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分子標(biāo)記—AFLP原理和操作步驟
閱讀：684 發(fā)布時間：2018-12-28實(shí)驗方法原理 AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測出來,。實(shí)驗中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接,，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn),。實(shí)驗中,，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的,。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內(nèi)切酶片段,，進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致特異性擴(kuò)增,。
實(shí)驗材料 DNA樣品
試劑、試劑盒 Taq酶EcoRI MseIEcoRI MseI接頭E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物瓊脂過硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸銀甲酰胺dNTPs二甲苯青冰醋酸玻璃硅烷50bpMark
儀器,、耗材 電泳儀離心機(jī)Eppendorf管凝膠成像儀紫外分光光度計37℃水浴鍋PCR儀
實(shí)驗步驟
一,、基因組DNA提取和純化
1. 大量提取DNA（實(shí)驗方法視DNA來源而異，此處略）,。
2. DNA的純化：
（1）用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小,，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化。
（2）首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul,，再等體積苯酚/異戊醇（25：24：1）,、異戊醇（24∶1）各抽提一次。
（3）離心吸上清液于Eppendorf管中,，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無水乙醇,，——20℃放置2h以上。
（4）10000xg離心10min,，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,，風(fēng)干后溶于30μl TE緩沖液中。
（5）紫外分光光度計檢測A260,、A280值并定量,，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小,。
注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織,，溶液E可增加至300ul,，此時DNA濃度大約為100ng/ul。
二,、限制性酶切及連接
1. 在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng,，2.5μl 10×酶切緩沖液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液,，5U EcoRⅠ,， 5U MseⅠ，2U T4連接酶,，50pmol MseⅠ接頭,，雙蒸水補(bǔ)至25μl。
2. 用PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過夜反應(yīng)后,，于65℃,，20min滅酶活，——20℃保存,，作為預(yù)擴(kuò)增模板,。
三、預(yù)擴(kuò)增
1. 取3μl酶切連接產(chǎn)物,，加入75ng E+A,，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+,，25mmol/L dNTPs,，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液,，加雙蒸水補(bǔ)至30μl,。
反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 90s；94℃ 30s,，56℃ 1min,，72℃ 1min，30循環(huán),；72℃ 10min,。
2. 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍,，用作選擇性擴(kuò)增模板。
四、選擇性PCR擴(kuò)增
1. 取釋稀后的產(chǎn)物3μl,，加入EcoRⅠ選擇性引物,、MseⅠ選擇性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+,，25mmol/L dNTPs,，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液,，加雙蒸水補(bǔ)至30μl,。
反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 90s；94℃ 30s,，65℃ 1min,，72℃ 1min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）,；94℃ 30s,， 56℃ 1min，72℃ 1min,，25循環(huán),；72℃ 5min.
2. 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物,。
五,、凝膠電泳
1. 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離）。拔出梳子,，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘,，溫度達(dá)到47——49℃。務(wù)必使每個孔清洗出尿素,。
2. 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺,，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青,，0.25%溴酚藍(lán)）94℃變性5 min,，結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣,。
3. 每個泳道加樣8μl,。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部,，再調(diào)到60W恒功率電泳,，溫度保持在43℃左右，待二甲苯青泳動至玻璃板2/3處,，結(jié)束電泳,。
六、銀染
1. 固定液配制：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。
染色液：1g AgNO3 ,，1.5ml 37% 甲醛,，加去離子水至1L。
顯色液：30g Na2CO3,，1.5ml 37% 甲醛,，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L,。
2. 具體操作流程
（1）電泳完畢后,，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。
（2）固定：加入固定液,，在搖床上輕微震蕩30min,。固定結(jié)束后，固定液保留,。
（3）加入去離子水漂洗3次,，每次2min。
（4）染色：將凝膠放入染色盤中,，倒入染色液（4℃）,，在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后,，置入顯色盤中,。
（5）顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止,。
（6）終止：加入（2）步驟用后的固定液,，來回漂幾分鐘。達(dá)到效果后,，用蒸餾水漂洗幾分鐘,。
（7）去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用數(shù)碼相機(jī)拍照,。
七,、數(shù)據(jù)分析
用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計，再用NTSYS軟件計算出遺傳相似性系數(shù),，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖,。