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雞胚胎成肌細胞的分離和培養(yǎng)實驗
閱讀：635 發(fā)布時間：2018-12-19雞胚胎成肌細胞的分離和培養(yǎng)實驗
試劑,、試劑盒 HBSS胰酶溶液膠原溶液
儀器、耗材 解剖顯微鏡不銹鋼深盤Dumom 5 號鉗子柳葉刀精細彈簧剪紙巾大燒杯試管架移液管血細胞計數板
實驗步驟
器材準備
1. 在培養(yǎng)室實驗臺上放置下列物品：
解剖顯微鏡
表面和透射照明用的顯微鏡燈泡
裝有 70% 酒精的帶蓋不銹鋼深盤
Dumom 5 號鉗子,，至少兩把
柳葉刀 4 把
精細彈簧剪一把
洗瓶,，內裝 75% 酒精
紙巾
盛裝廢棄雞蛋的大燒杯
墊放培養(yǎng)皿的紙巾
100 mm X 20 mm 的培養(yǎng)皿
裝有 Polytowel 的加蓋不銹鋼盤
放大倍數 100 （物鏡X目鏡）的組合顯微鏡，計數細胞用
2. 在培養(yǎng)室超凈臺上放置下列物品：
本生燈
可傾斜擺放 15 ml 試管的試管架
盒子,，內裝：離心管,，加有棉花塞的巴斯德吸管，吸球
獨立包裝的移液管 1 ml,、5 ml 和 10 ml
泵
血細胞計數板
Hank 氏平衡鹽溶液（HBSS）及無 Ca2+ 無 Mg2+ 的 HBSS
2.5% 胰酶溶液
2 個裝有一半體積 HBSS 的 35 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿
25 ml 規(guī)格的燒瓶
(1) 把幾張 lens 紙剪成 2 英寸X2.5 英寸的小長方形,，以 Swinny 濾器支持板為模板把一疊濾紙剪成圓片，并在超凈臺中用洗滌,，前后共 2 小時，換 2~3 次溶液,。
(2) 用無水乙醇洗滌 2 小時,，其間換液 2~3 次。
(3) 用蒸餾水洗膜 5~10 遍并浸入水中過夜,。
(4) 取一蓋玻片,，部分插入水中，用小鉗子把圓紙片拖上蓋玻片,，然后紙片朝上放在超凈臺的紙巾上直至紙片干燥為止,。
(5) 將上述小圓紙片連同蓋玻片一同放進密閉的培養(yǎng)皿中保存，或用小鉗子小心將小圓紙片揭下單獨保存。
(6) 裝 Swinney 濾器,。按如下順序先裝下半部：墊圈,，濾膜支持物，lens 紙片,，O 型墊圈及濾器上半部,，上下兩部分先松松地擰在一起。
(7) 在凸出的出料口處插入一支 18# 或更大規(guī)格的針頭,。放進培養(yǎng)皿中,，貼上高壓滅菌帶置 Fast-dry 中高壓滅菌。
(8) 使用：擰緊濾器,，安上注射器推進桿,。
3. 超凈臺中準備膠原包被的組織培養(yǎng)平皿
(1) 融化膠原溶液（Life Technologies）：4℃ 過夜或 37℃ 水浴 15 分鐘。
(2) 制作涂布器：煤氣火焰加熱融化巴斯德吸管頭部,，在其后 1/2 英寸處加熱直至融化彎成直角,，晾涼待用。
(3) 往培養(yǎng)板上滴數滴膠原液,。35 mm 規(guī)格的平板需要 1~2 滴,，100 mm 規(guī)格的平板需要 3~4 滴。
(4) 用涂布器把膠原涂布均勻,，務必使邊緣也布滿,。
收集和解剖胚胎
4. 用 70% 酒精擦拭實驗臺面，解剖鏡和燈放在一側,。
5. 鋪紙巾,，上放一排培養(yǎng)皿，一個用以盛放收集到的胚胎,，其余的放置開過口的雞蛋,。
6. 裝廢棄雞蛋的燒杯也就近擱置。
7. 小心地捏著無菌毛巾的折邊從盒中取出放在計數板上,，折邊向遠離你的一邊,。捏著毛巾的長邊邊緣小心打開。從酒精中拿出器械,，注意尖頭向上,，然后尖頭朝折邊放在毛巾上，再重新蓋好,。
8. 用 70% 的酒精擦拭或噴淋 11 日齡的雞蛋,，然后敲碎，放進培養(yǎng)皿中,。用鉗子輕輕夾著胚胎頸部,，垂直拎出放在另一個培養(yǎng)皿中,。以同樣的方式收集所有的胚胎。若是死胎,，全扔掉,，包括培養(yǎng)皿。
9. 胚胎移至解剖鏡下,，光強度至小的表面光線,，用鑷子把胸部皮膚剝離。
10. 用兩把鉗子固定住胚胎,，從胸腔肋骨處剪開肌肉,，先緊貼并沿著胸骨方向切一口，再一直切到翅膀連接處,，肌肉一離開附著點立即收縮,，緊貼并沿著胸腔肋骨切一小口一直拉至翅膀連接使肌肉*脫離下來，放進裝有 HBSS 溶液的 35 mm 培養(yǎng)皿中,，以同樣的方式分離另一半胸肌肉組織,。
11. 所有肌肉收集完后，于解剖鏡下檢查,。解剖鏡配上比第9步更大功率的透射光源,。
12. 清理*部肌肉后，把培養(yǎng)皿放在解剖鏡平臺上,，操兩把解剖刀將肌肉組織切成 1 mm3 見方的塊,。巴斯德吸管套上橡皮吸球吸些 HBSS 溶液入培養(yǎng)皿。
13. 挑起組織塊并轉移至一燒杯內,，杯中裝有 10 ml 用 HBSS 溶液配制的 0.25% 胰酶,。該酶無鈣和鎂離子。鋁箔包住燒杯口放進 37℃ 二氧化碳溫箱中孵育 20~30 分鐘,。
胰酶消化細胞
14. 將上述肌肉組織轉移至一離心管中,，在醫(yī)用離心機上中等轉速離心 2~3 分鐘使肌肉組織剛好能沉入管底，不要離心太久形成堅實的團塊,。
15. 小心將胰酶倒入一無菌培養(yǎng)皿中,。
16. 離心管中加入 2 ml 肌肉細胞用培養(yǎng)基（8:1:1）。
17. 先查看一下加棉塞的巴斯德吸管尖頭,，保證光滑均勻無裂口,，套上吸球吸些許培養(yǎng)基浸潤其內壁。然后插到離心管底,，輕輕吹打,。
18. 加入 3 ml 8:1:1 培養(yǎng)基,，稍加吹打讓細胞分散均勻,，然后通過了 lens 濾紙的 Swinney 濾器過濾至一新管中。
計數、接種細胞
19. 計數細胞,。
20. 每只 35 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿細胞接種密度是 3X105 細胞/ml,，共 1.5 ml。大量培養(yǎng)時,，如用 100 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿,，通常每只培養(yǎng)皿接種 10 ml 的 5X105 細胞/ml 的細胞。
21. 于 37℃,，5% CO2 水套式溫箱中培養(yǎng)細胞,。頭三天，每天更換培養(yǎng)基,，以后,，隔一天換一次。