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實(shí)驗(yàn)方法原理    通常用酶消化腺瘤,，用手術(shù)刀片將癌組織切碎,。如果分化良好的結(jié)腸直腸癌標(biāo)本切開后仍不易分離細(xì)胞,，可用酶消化方法分離,。
實(shí)驗(yàn)材料    用于傳代培養(yǎng)的Dispase
試劑、試劑盒    生長(zhǎng)培養(yǎng)液洗液消化液
儀器,、耗材    培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟    
一,、酶消化

1. 用洗液（洗液：添加 5% FBS、200 U/ml 青霉素,、200 μg/ml 鏈霉素和 50 μg/ml 慶大霉素,。在原代培養(yǎng)時(shí)，慶大霉素的作用至少維持一周,，然后除去,。）清洗腫瘤標(biāo)本 4 次。

2. 將組織塊放入小量洗液中,，洗液恰好浸沒組織塊（避免組織干）,。用交叉的手術(shù)刀片或鋒利手術(shù)剪將組織塊剖成約 1 mm3 小塊。

3. 通過用臺(tái)式離心機(jī)離心（300 g,，3 min）,，將組織塊清洗 4 次。清洗次數(shù)以經(jīng)驗(yàn)而定,，并根據(jù)細(xì)胞污染情況,。

4. 將組織塊放入消化液（消化液：DMEM,，添加的抗菌素同洗液，并添加 1.5 mg/ml 膠原蛋白酶（ IV型,，Worthington）,、0.25 mg/ml 透明質(zhì)酸酶（ I 型，Sigma）和 2.5%~5% FBS,。盡管常用 Worthington 公司生產(chǎn)的膠原蛋白酶,，也可試用 Sigma 公司生產(chǎn)的培養(yǎng)級(jí)別的膠原蛋白酶。）,，在 37℃ 條件下?lián)u晃,，通常過夜（約 12~16 h )。由于消化是一個(gè)緩慢過程,，組織塊在消化液中的時(shí)間多少并不要緊,，重要的是在此過程中不讓消化液變?yōu)樗嵝浴５?pH 說明組織塊在消化液中的時(shí)間過長(zhǎng)或放入消化液中的組織塊過多,。將約 1 cm3 腫瘤組織放入 20~40 ml 消化液,。

二、非酶消化

腺瘤總是需要用酶消化,。然而,，常發(fā)現(xiàn)在用手術(shù)刀片將癌組織切成 1 mm3 、時(shí)小的細(xì)胞簇從腫瘤組織脫落入洗液中,。在這種情況,，可按下列步驟操作。

1. 收集含有脫落細(xì)胞簇的洗液,。

2. 將離心管放置幾分鐘,，通過重力使細(xì)胞簇沉降，將組織塊與小的細(xì)胞簇分開,。

3. 吸出上清液,。

4. 直接培養(yǎng)剩下組織塊，或者將組織塊放入洗液內(nèi),，輕輕搖晃 30~60 min,，以便使更多的小細(xì)胞簇脫落下來(lái)，然后收集細(xì)胞簇,，種植于培養(yǎng)皿內(nèi),，與剩余的組織塊分開培養(yǎng)。

5. 在種植于培養(yǎng)皿內(nèi)之前,，將所有標(biāo)本洗 3 次,。

三、原代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件

1. 在預(yù)涂膠原蛋白和種植飼養(yǎng)細(xì)胞的 25 cm2 培養(yǎng)瓶,，用 4 ml 培養(yǎng)液培養(yǎng)從腫瘤組織分離的上皮性小管和細(xì)胞簇,。

2. 在含有 5% CO2 和 37 ℃ 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。

3 . 每周換培養(yǎng)液兩次。

小管和細(xì)胞在 1~2 d 內(nèi)開始附著底物,，上皮細(xì)胞遷移出來(lái),。大多數(shù)小管和小的上皮塊在 7 d 內(nèi)貼壁，但大的類器官物需要 6 周才能貼壁,，盡管貼壁時(shí)間有所變化,。

如果將細(xì)胞接種于預(yù)涂膠原蛋白的培養(yǎng)瓶（Biocoat，B-D Biosciences）,，在原代培養(yǎng)過程中上皮容易貼壁,。與無(wú) 3T3 詞養(yǎng)層相比，將細(xì)胞接種于 3T3 飼養(yǎng)層上時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)非常好,。當(dāng)上皮細(xì)胞克隆擴(kuò)增至每個(gè)克隆有幾百個(gè)細(xì)胞時(shí),，它們變得不依賴于 3T3 飼養(yǎng)層，故不必再加入詞養(yǎng)層細(xì)胞,。

四、繼代培養(yǎng)和擴(kuò)增

不能用常規(guī)的胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理方法對(duì)大多數(shù)結(jié)腸直腸腺瘤的原代細(xì)胞和腺瘤細(xì)胞系進(jìn)行傳代 [ Paraskeva et al.,， 1984,，1985 ]。由于用 0.1 % 胰蛋白酶（用 0.25 mmol/L EDTA 配制）將腺瘤細(xì)胞分散為單細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)很差,，故換用 Dispase,。

1. 將 Dispase 液注于細(xì)胞單層上，恰好浸沒細(xì)胞（每個(gè) 25 cm2 培養(yǎng)瓶約 2.5 ml）,。對(duì)原代細(xì)胞處理 40~60 min,，而對(duì)細(xì)胞系處理 20~40 min。

2. —旦上皮細(xì)胞層開始去附著（去附著的是細(xì)胞片,，而不是單細(xì)胞）,，用吸管吹打，以促進(jìn)去附著,，使細(xì)胞片分散成細(xì)胞簇,。

3. 在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下清洗和種植細(xì)胞。幾天后細(xì)胞簇去附著,，故應(yīng)輕輕換液,。