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皮層／海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理    
神經(jīng)元在發(fā)育過(guò)程中早于膠質(zhì)細(xì)胞，因此通常選擇胎鼠做腦內(nèi)神經(jīng)元培養(yǎng),。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神經(jīng)元培養(yǎng),。新生1d的仔鼠也可以用來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)元，但培養(yǎng)成功后雜細(xì)胞較多,，有時(shí)需要進(jìn)一步純化,。這兩個(gè)部位的細(xì)胞培養(yǎng)方法類似
實(shí)驗(yàn)材料    El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠新生Id的仔鼠
試劑、試劑盒    含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺）
儀器,、耗材    培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.根據(jù)離心前細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果,，先用少量神經(jīng)元維持培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，充分重懸后,，補(bǔ)加液體至合適體積,，按照(2-4)x104/cm2的密度在培養(yǎng)板、玻片等介質(zhì)上接種細(xì)胞,，并置于37℃孵箱培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)過(guò)程中接觸細(xì)胞要注意動(dòng)作輕柔,，接種Id后應(yīng)避免把細(xì)胞從孵箱中拿出,，可根據(jù)培養(yǎng)液的顏色和亮度觀察污染情況（污染的細(xì)胞，培養(yǎng)液混濁,、發(fā)黃,；正常應(yīng)該是清亮透明的）。3d后1/3量換液,，并可利用神經(jīng)元標(biāo)志物的免疫化學(xué)染色鑒定純度,。第5天起每隔2d 1/2量換液，并可以根據(jù)神經(jīng)元的成熟程度用于實(shí)驗(yàn),。

3.如果覺得神經(jīng)元純度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)的要求,，可以添加阿糖胞苷（終濃度為5µM),作用2d后，1/2量換液,，逐漸去除,。

培養(yǎng)成功的神經(jīng)元，無(wú)污染,，相差顯微鏡下細(xì)胞折光性好,，細(xì)胞碎片很少或沒(méi)有，突起長(zhǎng),，培養(yǎng)基清亮,，細(xì)胞有一定的間距，沒(méi)有成團(tuán)存在,，分布均勻,，而且沒(méi)有太多的雜細(xì)胞。培養(yǎng)不太好的細(xì)胞，雜細(xì)胞多,，神經(jīng)元狀態(tài)一般或很差,，細(xì)胞碎片較多
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注意事項(xiàng)    
1.神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)常為1/2量換液，在換液前應(yīng)將培養(yǎng)液在37℃水浴鍋中充分復(fù)溫,，冷刺激和全量換液刺激都會(huì)使細(xì)胞活力下降,。

2.鼠齡越大，其神經(jīng)元的培養(yǎng),，操作越要輕柔精細(xì),，關(guān)鍵在于消化過(guò)程和吹打過(guò)程。消化時(shí)間,、吹打次數(shù)對(duì)細(xì)胞活力的影響在原代培養(yǎng)中是大的,。在保證可以獲得足夠單細(xì)胞懸液的前提下，應(yīng)適當(dāng)縮短操作時(shí)間和步驟,。

3.海馬和皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)沒(méi)有大的區(qū)別,，皮層細(xì)胞豐富，很容易收集細(xì)胞,，但是雜細(xì)胞較多,。

4.利用孕鼠做神經(jīng)元的培養(yǎng)，純度高于新生鼠,，而且活力更好,。培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時(shí)，孕期不足,，海馬尚未*形成,，較難分離，但是取皮層就沒(méi)關(guān)系了,。
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其他    
實(shí)驗(yàn)心得：

1.應(yīng)用阿糖胞甘作用于神經(jīng)元,，細(xì)胞純度會(huì)高一些。1/2量換液去除時(shí),，雖然會(huì)存在殘留,，但是這樣的濃度對(duì)神經(jīng)元活性的作用基本可以忽略。

2.在包被玻片時(shí),，習(xí)慣將8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中,，一片一片的加，加完后用彎管小心吹勻,，蓋上皿蓋后,，輕輕震搖。再放入孵箱包被過(guò)夜,。包被結(jié)束后,，以無(wú)菌水漂洗2遍,，并以彎攝一片一片的夾出來(lái)，置于已滅菌的紗布上,，超凈臺(tái)內(nèi)吹干,。

3.接種細(xì)胞爬片時(shí)，先以(2-4)X105/100µL的濃度配好單細(xì)胞懸液,，在玻片上接種100µL,靜置20min后,，移至培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3h后補(bǔ)液至400µL,。這種方法接種的細(xì)胞能夠均勻分布于爬片上,。

4.為了避免長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)出現(xiàn)培養(yǎng)液變干的情況，可以在培養(yǎng)板每孔之間的間隙加無(wú)菌水,。