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黑素細(xì)胞的培養(yǎng)
閱讀：646 發(fā)布時間：2018-12-13實驗方法原理 胰蛋白酶消化后,，用 EDTA 分散從皮膚片分離的表皮片,，然后用添加 bFGF（FGF-2）的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng),。
實驗材料 D-PBSA胎牛血清大豆胰蛋白酶抑制劑
試劑,、試劑盒 添加激素的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液胰蛋白酶和EDTA混合液
儀器,、耗材 組織培養(yǎng)皿吸管離心管濕潤的培養(yǎng)箱水浴箱電子細(xì)胞計數(shù)儀或血細(xì)胞計數(shù)板
實驗步驟
原代培養(yǎng)
第 1 天
1. 用 70 % 乙醇浸洗皮膚標(biāo)本，然后用 D-PBSA 浸洗 2 次,。
2. 將組織移入無菌 100 mm 培養(yǎng)皿,，表皮面朝下,。
3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部。
4. 將剩余的組織用手術(shù)刀切成 2 mm × 2 mm 小塊,。刀片在組織上搖動,，但不要采用鋸切。
5. 將組織塊移入盛有冷的 0.25 % 胰蛋內(nèi)酶的 15ml 離心管,。
6. 在室溫條件下,，將組織塊孵育 60~90 min 。對于某些供體的皮膚,，先在 4°C 條件下孵育 18~24 h,，然后在 37°C 條件下孵育 1~2 h，這樣可獲得較多的黑素細(xì)胞,。
第 2 天
7. 輕拍離心管,，使沉于底部的組織塊移動。然后,，將離心管內(nèi)的內(nèi)容物快速倒入 60 mm 培養(yǎng)皿,。
8. 用手術(shù)鑷將組織塊逐一地移入 100 mm 干培養(yǎng)皿，上皮面朝下,。輕輕搖動組織塊,，使其接觸培養(yǎng)皿底壁。應(yīng)使表皮層附著在培養(yǎng)皿上,，以便用手術(shù)鑷*分離,。除去片。
9. 將表皮片移入盛有 5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的 15 ml 離心管,。注意將表皮片放入 EDTA 液,，不要貼在離心管壁上。
10. 輕輕搖晃離心管,，使表皮片分散成單細(xì)胞,。
11. 離心（350 g，5 min）,，然后吸去上清液,。
12. 用 MHSM 混懸細(xì)胞。
13. 用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞,，然后在 35 mm 培養(yǎng)皿用 2 ml 含有 5 % FBS 的 MHSM 孵育細(xì)胞,，細(xì)胞密度為1×106 個（約2×104~4×104 個黑素細(xì)胞）。FBS 促進細(xì)胞貼壁,。
14. 用含有生長因子和牛垂體提取物的 MHSM 換液,，每周 2 次。
第 3~30 天
15. 培養(yǎng) 24 h 后，培養(yǎng)的細(xì)胞中含有原代角質(zhì)形成細(xì)胞和散在的黑素細(xì)胞,。角質(zhì)形成細(xì)胞在幾天后停止增殖,，角質(zhì)形成細(xì)胞克隆在第 2 周浮起。第 2 周末,，只剩有黑素細(xì)胞,。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞在 2~4 周內(nèi)生長接近匯合,，此時準(zhǔn)備傳代,。
代。
傳代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
16. 用 0.02% EDTA（0.7 mmol/L）輕輕浸洗細(xì)胞 2 次,。
17. 加入 3 ml 0.25 % 胰蛋白酶和 0.1 % EDTA（2.5 mmol/L）混合液,，在 37°C條件下孵育。每 5 min 在相差顯微鏡下觀察 1 次,，檢査細(xì)胞的去附著情況,。
18. 當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞去附著時，用 10 μg/ml 大豆胰蛋白酶抑制劑或 1 ml 含有小牛血清的培養(yǎng)液使胰蛋白酶失活,。傳代時,，“血淸刺激”有益于在無血清條件下維持黑索細(xì)胞生長。
19. 吹打培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,，保證全部黑素細(xì)胞去附著,。
20. 吸出細(xì)胞懸液，離心（350 g,，5 min ),。
21. 吸去上淸液，用含有 5 % FBS 的無鈣黑索細(xì)胞培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,。每個 100 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)放入 2×104~ 4×104 個細(xì)胞,。黑素細(xì)胞很好地貼于塑料培養(yǎng)皿（> 75 % ) 要 FBS。但是,，如果培養(yǎng)皿涂有纖連蛋白或 Ⅰ 型膠原蛋白和 Ⅲ 型膠原蛋白混合物，可不用 FBS [ Gilchres te al.,，1985 ] ,。
22. 用無血清或含有血淸的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液換液，每周 2 次,。用含有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)能獲得較多的細(xì)胞,，但含有血淸的培養(yǎng)液促進成纖維細(xì)胞的生長。將 Ca2＋ 濃度降至 0.03 mmd/L 不影響黑素細(xì)胞的增殖,，但抑制成纖維細(xì)胞的過度生長 [ Naeyaert et al.,，1991 ]。
添加激素的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：
(a)199 培養(yǎng)液（400-1200,，GIBCO）：93.1 ml,；
(b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，儲存濃度為 10 μg/ml,，終濃度為 10 ng/ml,；
(c)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為 10 mg/ml,，終濃度為 10 μg/ml,；
(d)胰島素（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為10 mg/ml,，終濃度為 10 μg/ml,；
(e)三碘甲狀腺原氨酸（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為 1 μmol/L,，終濃度為 1 nmol/L,；
(f)氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，儲存濃度為 0.28 mmol/L,，終濃度為 1.4 μmol/L,；
(g)霍亂毒素（Calbiochem）：1.0 ml，儲存濃度為 1 μmol/L,，終濃度為 1 nmol/L,。可用牛垂體提取物和雙丁酸環(huán)腺背酸代替霍亂毒素,。牛垂體提取物（Clcmetics）的儲存濃度為 35 μg/ml,，終濃度為 0.7 ng/ml。雙丁酸環(huán)腺汗酸（Sigma）的儲存濃度為 1 mmol/L,，終濃度為 100 μmol/L,；
(h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，儲存濃度為 200 ng/ml,，終濃度為 10 ng/ml,。