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小鼠胚成纖維細胞的培養(yǎng)和體外分化
實驗材料    母鼠
試劑,、試劑盒    PBS胰蛋白酶溶液DNase 溶液
儀器,、耗材    無菌解剖器械不銹鋼濾網(wǎng)燒瓶培養(yǎng)箱
實驗步驟    
1. 準(zhǔn)備下列試劑和材料：

確定懷孕期的母鼠（孕期14至6天）

無菌解剖器械（鑷子、剪刀,、手術(shù)刀片）

Cellector 帶收集裝置的不銹鋼濾網(wǎng),，1 mm 直徑篩網(wǎng)

內(nèi)有攪拌棒的 125 ml 無菌的胰蛋白酶消化的燒瓶

有攪拌盤的培養(yǎng)箱

無 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS

胰蛋白酶溶液

DNase 溶液（10 mg/ml）

MEF 生長培養(yǎng)基

MEF 凍存培養(yǎng)基

150 mm 和 100 mm 組織培養(yǎng)皿

2 ml 冷凍管

2. 殺死懷孕 14~16 天的母鼠，取出子宮,，放在盛有 PBS 的 100 mm 組織培養(yǎng)皿中,，取出胚胎，去胚胎外組織,，PBS 沖洗去血,。

3. 用無菌鑷子去胚胎頭和內(nèi)臟。

4. 胚胎轉(zhuǎn)移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 無菌離心管中,，輕輕顛倒兩次,。小心倒掉 PBS，再加 40 ml PBS 清洗,。倒掉 PBS,，留 10 ml 將胚胎轉(zhuǎn)移到 100 mm 培養(yǎng)皿。

5. 手術(shù)刀片細細切碎胚胎,，用鑷子擠壓使其通過無菌濾網(wǎng),。15 ml 胰酶溶液沖洗濾網(wǎng)兩次，解剖胚胎混合物轉(zhuǎn)移至 125 ml 胰酶消化的燒瓶,。加 400 μl DNase 粗品,，以免釋放出的 DNA 導(dǎo)致溶液過黏。

6. 濕潤的 5% CO2 溫箱中 37℃ 輕輕攪動孵育 30 分鐘,。

7. 由燒瓶側(cè)臂把上層細胞懸液倒入一裝有 10 ml MEF 生長培養(yǎng)基的 50 ml 離心管,。

8. 離心收集細胞。

9. 30 ml MEF 生長培養(yǎng)基洗兩次,。

10. 細胞懸于 15 ml 生長培養(yǎng)基,，用血細胞計數(shù)可存活有核細胞（非血紅細胞或碎片）。10 只 15 天幼鼠可獲得 5X107 到 1X108 細胞,。

11. 6X106 細胞懸于 25 ml MEF 生長培養(yǎng)基,，接種一塊 150 mm 培養(yǎng)皿（總計接種 10~15 塊）。

12. 24 小時后更換新鮮 MEF 生長培養(yǎng)基,。

13. 約 2~4 天后細胞長滿,，1:5 傳代。分 8 批操作,，15 ml PBS 沖洗,，倒掉,，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分鐘,。

14. 每塊胰酶消化的細胞板加 10 ml 生長培養(yǎng)基,，輕柔吹吸，分散細胞,，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管,，兩塊板的細胞合并到一管中。

15. 離心收集細胞,。細胞懸于培養(yǎng)基中,，1:5 分加到 150 mm 培養(yǎng)皿。

16. 約 3 天后細胞長滿,，可以收獲凍存于液氮中,。分 8 批操作，15 ml PBS 沖洗,，倒掉,，加 10 ml 胰酶，37℃ 孵育 5 分鐘,。

17. 加 10 ml MEF 生長培養(yǎng)基,，輕柔吹吸，分散細胞,，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管,。

18. 離心收集細胞。每塊培養(yǎng)皿收獲的細胞懸于 2 ml 凍存培養(yǎng)基,。

19. 每支冷凍管加 1 ml 細胞,，旋緊蓋子，-80℃ 冰箱過夜,。此步操作需迅速,。

20. 第二天將細胞轉(zhuǎn)移至液氮中。轉(zhuǎn)移過程中需放在干冰上避免升溫,。