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家兔椎間盤細胞培養(yǎng)實驗
閱讀：333 發(fā)布時間：2018-12-10實驗方法原理 首先建立家兔椎間盤細胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng),，其中,，組給予純氧，另外3組給予不同濃度的臭氧：30 μg/ml,，60 μg/ml和80 μg/ml,，然后于15 min及30 min后，采用臺盼藍細胞排斥試驗計算椎間盤細胞的活細胞率,。
實驗材料
家兔
試劑,、試劑盒
培養(yǎng)液DMEMHanks’緩沖液胎牛血清胰島素轉鐵蛋白鹽青霉素鏈霉素
儀器、耗材
培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶燒瓶試管眼科剪,、眼科鑷CO2 培養(yǎng)箱pH 計恒溫水浴
實驗步驟
一,、實驗步驟
1. 組織塊貼塊法
（1）取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態(tài)下獲取家兔椎間盤組織,。置于準備好的DMEM 培養(yǎng)基(含雙抗),。迅速帶回到無菌超凈臺上,。
（2）剪切：在超凈臺上，進一步將周圍組織分離,，用Hanks’液沖洗數(shù)遍,，直到沖洗液透明為止。眼 科剪刀將組織修剪為1~2 cm3 大小的小組織塊,，Hanks’沖洗干凈,。加入少量含血清的培養(yǎng)液。(組織塊不宜過小,，否則不容易爬出足夠數(shù)量的細胞),。
（3）接種：用吸管吸取小組織塊入培養(yǎng)瓶底部，擺放均勻,，一個25 cm2 的培養(yǎng)瓶可放置10-15 個小組織塊,，翻轉培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)液,。4~6 小時后,，待組織塊充分貼壁后，再翻轉回來(動作一定要輕巧,， 以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底),。
（4）于5% CO2 孵箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換液,。待細胞 95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶,。
2. 酶消化法
（1）前面步驟同組織塊貼塊法 1,、2。
（2）組織塊再進一步剪切,，此時培養(yǎng)液中不加血清,。
（3）完畢后，加入消化液,，移入到10 ml 離心管,，培養(yǎng)箱內消化。
（4）每隔20 分鐘,，用吸管吹打一次,，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體,，在相差倒置顯微鏡下觀察,。
（5）0.4%臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)目。
（6）接種密度在105 數(shù)量級,。置于5%CO2 孵箱中培養(yǎng),，每隔 3 天換液,。
（7）待細胞 95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶,。
二,、結果
IVD 細胞為類軟骨細胞，描述：單層細胞形狀不規(guī)則,，可呈三角形,、多角形，梭形及不規(guī)則形,。不同于成纖維細胞,。如下圖：
圖1：組織塊貼塊法
圖2：傳代細胞形態(tài)
收起
注意事項
椎間盤位于相鄰兩個椎體之間，取材過程較為繁瑣,， 要求動作迅速,，爭取在家兔死后半小時內完成，否則,，該組織對缺氧耐受性差導致培養(yǎng)失敗,。