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個別組織細胞的培養(yǎng)
閱讀：395 發(fā)布時間：2018-12-5體內(nèi)組織細胞在體外培養(yǎng)時,，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,，但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,，各自要求條件有一定差別,，所采取的培養(yǎng)
技術(shù)措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細胞培養(yǎng)的要點如下:
一,、上皮細胞培養(yǎng)
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝,、胰、乳腺等的功能成分,，又由于癌起源于上皮組織,，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中常混雜
有成纖維細胞,，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞,，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存,，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵,。
體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長,，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射
后）時,，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH,、Ca2+含量和溫度,，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長,。
以表皮細胞為例,，用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1,、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者,，切成0.5－1平方厘米小塊,。
2、置0.02%EDTA中,，室溫,，5分鐘。
3,、換入0.25%胰蛋白酶中,，4℃過夜。
4,、分離：取出皮塊,，用血管鉗或鑷子將表皮與層分開,。
5,、取出表皮，剪成更小的塊后,，置0.25%胰酶中,，37℃，30—60分鐘,。
6,、反復(fù)吹打，制成懸液,。
7,、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后,，低速離心，吸去上清,。
8,、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶,，CO2溫箱培養(yǎng),。
二、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞,，對于研究內(nèi)皮細胞再生,、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。
研究人內(nèi)皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法為簡便,，其法如下：
1,、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段,，如不能立即培養(yǎng),，可于12小時內(nèi)保存于4℃。
2,、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流,。
3,、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,，充滿血管,，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎,，以防液體返流,。
4、吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液,，于離心管中,，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）,。5,、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)
液制成細胞懸液,，接種入培養(yǎng)器皿中,，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。
三,、神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)
神經(jīng)細胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng),，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上,，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時,，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突
起等現(xiàn)象,，但很難使之增值,。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。
人,、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng),，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系,。一般說來,，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)
定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化,，但對外界因素仍保持很好的敏感性,，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。
養(yǎng)方法如下：
1,、從手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后,，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分,，置Hanks液中漂洗一,、二次。
2,、置于30—50倍體積的Hanks液中,，此時腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細胞懸液,。
3,、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉,，脂肪等雜物易漂浮,，可吸除上層、反復(fù)二,、三次,，即可排除脂肪成分和其它
碎塊并獲較多細胞成分。
4,、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)成紗布過濾，計數(shù)并調(diào)整細胞密度,。
5,、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng),。
該細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長,，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細胞分裂現(xiàn)象,，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態(tài),。細胞傳代可以
0.25%胰酶消化處理。
四,、肌組織培養(yǎng)
各種肌組織均可用于培養(yǎng),，以心肌和骨骼肌較實用。
（－）骨骼肌細胞培養(yǎng)
1,、出生1一2天的乳鼠,，引頸處死。
2,、無菌取大腿肌組織,，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過,。
3、計數(shù)調(diào)整細胞密度,。
4,、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5,、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,，可加1%的胎汁以促進分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化,，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠,。
該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形,，培養(yǎng)50－52小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維,。數(shù)日后融合停止，此時可觀察到橫紋,，一般在融合
后二,、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。
（二）心肌細胞培養(yǎng)
心肌細胞是早的培養(yǎng)材料,，Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織,，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,，常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養(yǎng)和生長,，可用懸滴培養(yǎng),、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果,。取心室肌培養(yǎng)較好,，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)
成功時,，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象,。
五、巨噬細胞培養(yǎng)
巨噬細胞屬免疫細胞,，有多種功能,，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象,。巨噬細胞容易獲得,，便于培養(yǎng)，并可進行純化,。巨噬細胞
屬不繁殖細胞群,，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng),，難以長期生存,。
巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠,，如P338D1,、S774A.1、RAW309Cr.l等,，均獲惡性,，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁
分離,，但難以建株,。
培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法為實用,，其法如下：
1,、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。
2,、引頸處死小鼠,。
3,、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4,、置動物于解剖臺,，用針頭固定四肢,，持鑷撕開腹部皮膚,，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè),，暴露出腹膜壁,。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁,，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動,。
6,、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。
7,、小心拔出針頭,，把液體注入離心管。
8,、4℃下250g離心10分鐘后,，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基,。
9,、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞,，其中90%為巨噬細胞,。
10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種,。
11,、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液,，可去除其它白細胞,，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1一2次,，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中,。
六、腎小球分離,、移植培養(yǎng)
SD大鼠頸椎脫臼法處死,，75%乙醇浸泡1～2分鐘,，2次，置超凈臺內(nèi),，打開腹腔取出腎臟剪碎,，置含Hank’s液的無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)
上,。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),，濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過,，去小組織塊,，濾過物吸至200目不
銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過,，Hank’s液洗滌1次,，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球,。腎小球用0.2%胰酶,、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘,，加血
清終止胰酶反應(yīng),，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,，使腎小球大于60個/cm2,，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組
成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清,；2.5%胎牛血清,；胰島素5μg/ml；25ng/ml,；5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素
0.02ng/ml,；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天,，去除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,，形態(tài)學(xué)觀察：細胞生長成單層多角型細胞,，直徑
約100μm。
七,、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘,，在消化過程中用吸
管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推
動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上,。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細胞,。