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單抗與多抗該怎么選擇了解一下,？
閱讀：1125 發(fā)布時(shí)間：2018-11-29抗體是生物學(xué)科研工作中有力的工具,，沒(méi)有之一。這些“制導(dǎo)武器”,，會(huì)在研究中主動(dòng)尋找并結(jié)合研究者感興趣的目標(biāo),，并可通過(guò)各種示蹤技術(shù)將目標(biāo)展現(xiàn)出來(lái),。正是由于抗體的專一特性，研究者可能會(huì)依賴于示蹤實(shí)驗(yàn)所顯示的結(jié)果對(duì)所研靶標(biāo)給出定性或定量的判斷,。也正因此,，毫無(wú)疑問(wèn)的，專一性或特異性是抗體科研工作者關(guān)注的特性,。那么,，抗體特異性主要由什么決定？為什么常聽到多抗特異性不如單抗的說(shuō)法,？在實(shí)驗(yàn)中,，是該選擇單抗還是多抗？
下面我們將就抗體的生產(chǎn)制備過(guò)程分析抗體特異性差異的原因,。
- 我們不“生產(chǎn)”抗體,，我們只是大自然的“篩選”工
抗體的制備，無(wú)論是單抗還是多抗,，其前期的動(dòng)物免疫步驟是*相同的,，差異僅僅在篩選?；蛘哒f(shuō),，單抗是在多抗制備的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選并穩(wěn)定表達(dá)特異單克隆細(xì)胞株的結(jié)果,。當(dāng)抗原免疫動(dòng)物后,，在淋巴結(jié)和脾等淋巴器官內(nèi)通過(guò)一系列抗原處理和遞呈，促使B淋巴漿母細(xì)胞（Plasmablasts, PBs）分化成熟,，在轉(zhuǎn)錄水平成為分泌特異抗體的B淋巴漿細(xì)胞（Plasma cells, PCs）,，大量不同的漿細(xì)胞會(huì)分泌不同的針對(duì)抗原的抗體。由此,，可以說(shuō)每一個(gè)B漿細(xì)胞都成為一株單克隆抗體的候選者,。
傳統(tǒng)的單克隆抗體制備就是通過(guò)將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，篩選能夠分泌特異抗體并穩(wěn)定傳代的融合細(xì)胞株而實(shí)現(xiàn)的,。而多克隆抗體（多抗）的制備就是從血清中分離純化所有的未經(jīng)篩選的單克隆抗體,。從以上過(guò)程可以看出，無(wú)論是單抗還是多抗制備方法,，其針對(duì)靶點(diǎn)（抗原）的特異性抗體的產(chǎn)生主要源于被免疫動(dòng)物自身的漿細(xì)胞分化成熟,，抗體生產(chǎn)者（人）其實(shí)并沒(méi)有做什么。
不同在于,，多克隆抗體猶如許多單克隆抗體的集合,，它們有的特異性高，有的特異性低,，總體特異性符合正態(tài)分布曲線的形式（如Fig1）,，而其特異性的總體表現(xiàn)也應(yīng)處于統(tǒng)計(jì)學(xué)正態(tài)曲線中位線（MID）的水平,。而單抗制備后續(xù)的篩選過(guò)程，可去除大部分的非特異抗體,，保留幾株特異性較好的單克隆抗體,。
Fig1. 單抗與多抗特異性示意圖
- 傳統(tǒng)雜交瘤法篩選單抗的缺陷
然而，單抗制備過(guò)程中的細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)發(fā)生的過(guò)程,，動(dòng)物脾臟內(nèi)的各種細(xì)胞如內(nèi)皮,、平滑肌、巨噬,、NK,、T、還有紅細(xì)胞,、血小板等都可能與骨髓瘤細(xì)胞系發(fā)生融合,。盡管B細(xì)胞是脾臟內(nèi)主要的淋巴細(xì)胞，但能夠分泌特異性抗體的成熟漿細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例很低,，加之促細(xì)胞融合試劑如PEG等的細(xì)胞毒性,，使得終成功融合形成穩(wěn)定表達(dá)特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系的效率極低，大約為10-6,。因此，在單抗制備過(guò)程中,，大部分分泌特異性抗體的B細(xì)胞可能都被損失了,。終獲得的單克隆抗體其親和力和特異性可能都不是本次免疫中的。
Fig2. 單克隆抗體制備流程
假如把每個(gè)漿細(xì)胞比作一個(gè)士兵,，人就是指揮官,，指令新兵們訓(xùn)練打靶。打靶的次數(shù)（免疫次數(shù)）增多后,，會(huì)有越來(lái)越多的新成神槍手,。指揮官將好的神槍手挑出來(lái)，培養(yǎng)成一個(gè)一個(gè)的“手”（單克隆抗體）,。然而,，手的選拔機(jī)制卻是簡(jiǎn)單粗暴的，且與能力無(wú)關(guān),，比如能否舉起200 kg的杠鈴,，這可能將真正的手淘汰掉了。而多抗就像一個(gè)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的老兵連隊(duì),，既有槍法平庸的兵,，同時(shí)也擁有的手。
- 為什么應(yīng)用多抗會(huì)產(chǎn)生更多雜帶或更高染色背景,？
生物樣本的成分通常非常復(fù)雜,。雜帶或高背景通常是由于多克隆抗體中有的抗體克隆非特異地結(jié)合復(fù)雜樣本造成的,。如前所述，多抗所表現(xiàn)的特異性是多個(gè)抗體克隆的中位線水平,。所以從特異性上講,，多抗通常不如單抗。多抗特異性可通過(guò)生產(chǎn)環(huán)節(jié)比如使用高純度的免疫原,，以及使用提純的靶點(diǎn)蛋白對(duì)多抗進(jìn)行免疫親和層析純化等方法得以改進(jìn),。經(jīng)過(guò)免疫親和層析的多抗其總體特異性將大大提升，與單抗相比已相差無(wú)幾,。
另一方面,，不同生產(chǎn)廠商制備多抗的原理方法基本相同，然而在抗原設(shè)計(jì)及制備上千差萬(wàn)別,。如使用全長(zhǎng)蛋白,，則蛋白的表達(dá)純化，如使用多肽,，則多肽的位置選擇,，不同廠商都有各自的策略，這也使得針對(duì)同一靶點(diǎn)的多抗特異性相差較大,。在研究者的交流過(guò)程中也留下“多抗特異性差”的印象,。因而，如果使用多抗檢測(cè),，推薦更有經(jīng)驗(yàn),、口碑更好的生產(chǎn)廠商。
- 關(guān)于特異性的認(rèn)識(shí)誤區(qū)
一般而言,，單克隆抗體的確具有更高的特異性,，但這個(gè)特異性是指針對(duì)抗原上一個(gè)表位（epitope）或抗原決定簇（determinant）的特異性，而不是指針對(duì)整個(gè)靶點(diǎn)蛋白的特異性,。根據(jù)抗體核心的表位結(jié)合區(qū)域—互補(bǔ)決定區(qū)（Complementarity Determining Region,，CDR）的結(jié)構(gòu)，抗體通?？梢跃o密結(jié)合的抗原表面區(qū)域或表位面積很?。?lt;5 nm），對(duì)于變性的肽段約在4-8個(gè)Aa以內(nèi),，以及5-7個(gè)單糖的糖鏈或6-8個(gè)核苷酸的核酸,。通過(guò)肽段BLAST可以得知，小肽段序列*相同的情況將在很多不同蛋白上發(fā)生,。這意味著單抗識(shí)別的這個(gè)表位可能并不僅僅屬于靶標(biāo)蛋白本身,，也即意味著，即使利用純化抗原蛋白進(jìn)行了特異性篩選的單克隆抗體,，當(dāng)用其檢測(cè)復(fù)雜樣本時(shí),，也將面臨交叉反應(yīng)或假陽(yáng)性問(wèn)題,。這仍須以不同的檢測(cè)手段比如基因敲除等對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)。
Fig3. IgG分子結(jié)構(gòu)
- 多克隆抗體在敏感性上的優(yōu)勢(shì)
當(dāng)我們計(jì)劃利用抗體去抓出感興趣的靶點(diǎn)時(shí),，需要考慮抗體的特異性和敏感性兩個(gè)因素,。特異性決定了假陽(yáng)性結(jié)果的多少，敏感性決定了檢出率的高低,。在復(fù)雜樣本中,，由于多克隆抗體識(shí)別抗原的多個(gè)表位，可以在一個(gè)抗原分子上結(jié)合更多的抗體分子,，也可以在當(dāng)部分抗原表位受到一定程度的遮蓋或破壞時(shí),，仍有抗體結(jié)合在未受影響的表位上。這種情況常發(fā)生在如石蠟包埋的免疫組化（IHC-P）等實(shí)驗(yàn)中,，當(dāng)樣本經(jīng)甲醛交聯(lián)固定后,，即使經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)，抗原表位也不可避免地受到了影響,，此時(shí)單克隆抗體由于只識(shí)別一個(gè)表位,，結(jié)合能力可能大大降低甚至呈現(xiàn)陰性結(jié)果，而只要不是所有表位都受到了破壞,，多抗仍可以獲得該靶點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果,。同樣的，對(duì)于樣本中一些表達(dá)豐度極低的蛋白,，由于多表位結(jié)合更多抗體分子,，檢測(cè)信號(hào)就將被放大，因此,，使用多抗具有靈敏度和檢出率上的優(yōu)勢(shì),。
- 特異性與靈敏度的平衡
幾乎所有的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)都需要考慮特異性和靈敏度兩個(gè)參數(shù),。對(duì)于一項(xiàng)檢測(cè),，在一定范圍內(nèi)這兩個(gè)參數(shù)往往是對(duì)立的。更加嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)或更高的檢測(cè)閾值,，可以避免假陽(yáng)性出現(xiàn),，即特異性高；然而過(guò)高的標(biāo)準(zhǔn)會(huì)造成假陰性升高,，即靈敏度低,。用戶需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇抗體。相對(duì)而言,，樣本經(jīng)過(guò)了固定,、包埋、變性等預(yù)處理,，或靶標(biāo)蛋白本身在樣本中的表達(dá)豐度很低,，適合使用多克隆抗體檢測(cè),。
小結(jié)
單克隆與多克隆抗體差異總結(jié)
單克隆抗體 | 多克隆抗體 | |
制備周期 | 長(zhǎng)（5-6個(gè)月） | 短（2-3個(gè)月） |
技術(shù)要求 | 高 | 低 |
產(chǎn)量 | 高 | 低 |
價(jià)格 | 高 | 低 |
對(duì)免疫原要求 | 較高 | 高 |
特異性 | 高 | 高（抗原親和純化） |
識(shí)別表位 | 一個(gè) | 多個(gè) |
非特異結(jié)合 | 較少 | 較多 |
靈敏度 | 較高 | 高 |
標(biāo)準(zhǔn)化 | 易，批間差小 | 較難,，批間差大 |
穩(wěn)定性 | 較好 | 好 |
凝集反應(yīng) | 大多數(shù)沒(méi)有 | 有 |
沉淀反應(yīng) | 大多數(shù)沒(méi)有 | 有 |
中和活性 | 大多數(shù)沒(méi)有 | 有 |
為減少多克隆抗體制備中的批間差,，生產(chǎn)環(huán)節(jié)需要更加嚴(yán)格控制，每批次免疫動(dòng)物的數(shù)量至少三只,，以降低動(dòng)物個(gè)體差異影響,。動(dòng)物的來(lái)源、種系,、性別,、周齡、體重,、飼喂環(huán)境,、免疫原及免疫流程（SOP）等也嚴(yán)格保持一致，這樣可以有效控制多抗生產(chǎn)時(shí)的批間差,。
總之,，在不同實(shí)驗(yàn)中善用“手”和“老兵連隊(duì)”，可以更加地獲得所需的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。