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想要長期持有一個細胞系，策略是進行低溫保存,。這可以有效防止因污染或技術原因導致的細胞損失,。而低溫保存對于維持細胞株的遺傳特性也極為重要。
 
看似簡單的凍存細胞,，如果操作不當,，將導致長期培養(yǎng)的細胞付之東流。作為一個吃過虧的人,，告訴你細胞凍存是否成功取決于以下四個關鍵因素（文章結尾有福利，等不及的小伙伴可以拉至底部）,。
 
一,、適當的處理及溫和收集細胞
 
凍存前檢查
 
凍存前，細胞應處于指數生長期,，確保細胞處于健康狀態(tài),。理想情況下，應在收獲細胞前 24 小時更換培養(yǎng)基,。建議對培養(yǎng)物進行微生物污染物,，特別是支原體的檢測，并通過適當的方法,，如 STR 分析確定其身份,。
 
如果在培養(yǎng)過程中使用抗生素，那么建議在冷凍前 1 到 2 周不使用抗生素,，這樣如果出現污染,，可以更容易地發(fā)現,。
 
收集細胞
 
通常，您可以使用常規(guī)用于細胞傳代的實驗程序來收獲細胞,。細胞收獲期間盡可能溫和操作,。本程序推薦的試劑量是針對為 75 平方厘米（T-75）培養(yǎng)瓶；若使用其他培養(yǎng)容器,，請相應調整所用試劑量,。
 
1. 使用無菌吸管，取出并丟棄培養(yǎng)基,。請妥善處置與細胞接觸的任何材料和溶液,。
 
2. 用 5 到 10 ml CMF-PBS 沖洗細胞，去除所有痕量的血清,。
 
3. 加入 3 到 5 ml 的胰酶（在 CMF-PBS 中）,，37℃ 孵育。預熱酶溶液通常會縮短處理時間,。
 
4. 在倒置相差顯微鏡上每隔幾分鐘檢查酶處理的進展情況,。一旦細胞變圓，輕輕敲擊細胞瓶使其脫離塑料表面,。加入 5 ml 含血清的生長培養(yǎng)基滅活胰酶,。可能需要劇烈的移液操作來使培養(yǎng)容器底部的剩余細胞脫落,，或將細胞團塊分解成單細胞懸浮液,。胰酶的去除或失活對于冷凍細胞至關重要。如果游離試劑不能直接滅活,，可以通過下一步的離心去除,。
 
5. 用 15ml 離心管收集細胞。取出樣本進行細胞計數,，剩余的細胞懸液以約 100×g 離心 5 分鐘以獲得細胞沉淀,。離心時，用細胞計數板對細胞進行計數,。使用臺盼藍染液檢查細胞的活性,。
 
二、使用合適的冷凍保護劑
 
5%～10% 的甘油和 DMSO 是常見的凍存保護劑,。雖然 DMSO 對細胞有毒性,，但是與甘油相比，其滲入細胞的速度更快,，而且凍存重復性更好（細胞復蘇效率更好）,。
 
但是，DMSO 一方面會導致某些細胞（如 HL-60 早幼粒細胞）分化，另一方面對某些細胞（如 HBE4-E6/E7 肺上皮細胞）的毒性也過大,。對于這些細胞,，則應使用甘油。甘油可以通過高壓蒸汽滅菌,，而 DMSO 只能通過過濾除菌,。DMSO 或者甘油至少應達到試劑級（或者更別，如細胞培養(yǎng)級）,，并且分裝,，避光保存。
 
三,、細胞凍存的速率
 
有很多方法可以實現 1℃/min 的降溫速度,。電腦控制的可編程電子降溫系統是的方式，可以保持降溫速度,。這也是 ATCC 采用的方法,。但這種設備價格較高。比較經濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中,，在低于 –70℃ 的冰箱中凍存 24 小時,。已有一些商業(yè)化凍存盒產品能夠非常接近 1℃/min 的理想降溫速度。
 
四,、合適的儲存溫度
 
長期保藏需要超低溫（低于 -130℃）環(huán)境,，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中,。
 
要維護液氮中儲存的細胞需要記住以下幾點：
 
1. 確保標簽系統適用于低溫儲存,。
 
2. 保持良好記錄，包括細胞儲存位置,，生長特點和操作記錄,。
 
3. 請頻繁檢查液氮罐的狀態(tài)（每天或至少每周一次）。有多種商用警報系統可用于持續(xù)監(jiān)控其狀態(tài),。珍貴細胞應至少存放在兩個不同的地點,。
 
 
后，關于養(yǎng)細胞這件小事,，還想提醒大家一句：如果你購買了 ATCC 細胞系，為了保證培養(yǎng)基一致性的問題,，購買細胞時,，一起購買推薦培養(yǎng)基。因為來自于不同廠家的培養(yǎng)基,，即使名字相同或類似,，配方也略有差異。