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一,、設(shè)備和試劑
1．設(shè)備
① 電泳電源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 電泳儀及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 電轉(zhuǎn)儀及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE,，Catalog#88018
⑤ 濾紙
Whatman,3MM CHR

2.試劑
① 凝膠試劑
試劑名稱        廠家及規(guī)格
30%丙烯酰胺溶液        上海生工
Tris-Base        SIGMA
10%SDS        SIGMA
10%過硫酸銨        上海生工
TEMED        上海生工
② 常用溶液及緩沖液
A．5%積層膠所用溶液
B．分離膠溶液
C．電泳緩沖液,，1L
3g Tris-Base,、14.4g 甘氨酸、1g SDS,，加蒸餾水至IL,，pH應(yīng)該在8.3左右。也可以制成10×的儲存液,，在室溫下長期保存
D．電泳轉(zhuǎn)移緩沖液,1L
3g Tris-Base,、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸餾水至1L, 也可以制成10×的儲存液,，在濕溫下長期保存
E．5×樣品緩沖液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）,、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS,、0.5ml 2-巰基乙醇,、1ml 1%溴酚藍(lán)，0.9ml的蒸餾水,，可在4℃保存數(shù)周,，或在-20℃保存數(shù)月。
③ 二抗稀釋液
AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562;
AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422
一般采取1:3000-1:5000的稀釋度,，用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀釋
④ 顯色底物緩沖液
A.HRP標(biāo)記二抗底物緩沖液
DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）, Tris Buffer 3滴,，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光,，混勻
B.AKP標(biāo)記二抗底物緩沖液
AKP緩沖液：
0.1mol/L Tris-HCL（PH9.5）, 0.1mol/L NaCL, 5mmol/L MgCL2
BCIP溶液/NBT溶液：
50mg/ml BCIP溶于100%二甲基甲酰胺
50mg/ml BCIP溶于70%二甲基甲酰胺
⑤ 其他試劑
A．        考馬斯亮藍(lán)染液,，1L
考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0g、甲醇 450ml,、冰醋酸 100ml
B．        考馬斯亮藍(lán)脫色液
甲醇 100ml,、冰醋酸 100ml、蒸餾水800ml

二,、方法
1．Bio-Rad微型凝膠電泳模具的安裝
帶上手套將凝膠電泳系統(tǒng)的前后玻璃板,，梳子用去污劑洗滌,，后再用去離子水沖洗干凈，除去黏附在玻璃板上凝固的膠和其他污垢,。晾干玻璃板或用電吹風(fēng)吹干,。將玻璃板的橡膠墊條用吸水紙吸干，然后按Bio-Rad Mini-Protean電泳系統(tǒng)的使用說明書安裝好玻璃板,，固定于制膠板上,。

2．SDS-PAGE凝膠的配制
① 根據(jù)實驗檢測抗原的分子量大小選擇合適的電泳分離膠濃度。確定分離膠所需凝膠溶液體積（這些數(shù)據(jù)一般由廠家提供,，例如Bio-Rad Mini-Protean 3 Elecreophoresis Cel 83mm×75mm×0.75mm,兩塊膠需8ml）
按下表給出數(shù)據(jù)在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配置一定體積的分離膠溶液,。依次混合各成分。

10ml分離膠各成分所需體積（ml）
        濃度
溶液成分        8%        12%        15%
水        4.6        3.3        2.3
30%丙烯酰胺        2.7        4.0        5.0
1.5mol/L Tris(pH8.8)        2.5        2.5        2.5
10%SDS        0.1        0.1        0.1
10%過硫酸銨        0.1        0.1        0.1
TEMED        0.006        0.004        0.004
一旦加入TEMED,，馬上開始聚合,，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。
② 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液,，不能有氣泡,，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長再加1cm）。然后小心的在分離膠溶液上覆蓋一層1-5mm的水層,，這使凝膠表面變的平整,。
③ 等待30-60min，使凝膠聚合,。當(dāng)凝膠聚合后,，在分離膠和水層之間會出現(xiàn)一個清晰的界面，可以微微傾斜模具,，檢測凝膠是否聚合,。用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的凝膠，盡可能排去凝膠上的液體,，再用濾紙吸凈殘留液體,，注意不要接觸膠面。
④ 按下法制備積層膠：按下表給出數(shù)據(jù)在一個干凈的試管或小燒杯中制備一定體積濃度為5%的丙烯酰胺溶液,，依次混合各成分,。（兩塊5%積層膠Bio-Rad Mini-Protean 83mm×75mm×0.75mm, 兩塊膠需3ml）

不同體積積層膠各成分所需體積（ml）
       體積
溶液成分        2        3        5
水        1.4        2.1        3.4
30%丙烯酰胺        0.33        0.5        0.83
1mol/L Tris(pH6.8)        0.25        0.38        0.63
10%SDS        0.02        0.01        0.05
10%過硫酸銨        0.02        0.03        0.05
TEMED        0.002        0.003        0.005
一旦加入TEMED，馬上開始聚合,，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下一步操作,。
⑤ 在已聚合的分離膠上直接灌注積層液。立即在積層膠溶液中插入干凈的實驗預(yù)設(shè)計的梳子,，小心避免混入氣泡,，將凝膠垂直放置于室溫下。
⑥ 積層膠聚合*后（30min）,小心移出梳子,，使用洗瓶立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺,。把凝膠固定于電泳裝置上,，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。

3．SDS-PAGE電泳
① 將抗原（細(xì)胞裂解液,、重組蛋白）樣品置于凝膠加樣緩沖液中,，在100℃加熱三分鐘以使蛋白質(zhì)變性。
② 設(shè)計加樣順序,，作好實驗記錄,，按預(yù)定順序加樣。一般每個電泳道加樣大體積為25µl,每個電泳道上樣的低蛋白質(zhì)量（每一條蛋白質(zhì)條帶）：0.1µg（考馬斯亮藍(lán)染色）-2ng（銀染色）,高蛋白質(zhì)量（蛋白質(zhì)混合物）：20-40µg,。
③ 把電泳裝置與電源連接好,，將電壓調(diào)至200V，電流應(yīng)流向陽極,，待溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部0.5cm處,，關(guān)閉電源。
④ 從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板,，用去離子水沖洗干凈,。準(zhǔn)備進(jìn)行免疫印操作,。

4．免疫印跡操作-轉(zhuǎn)膜
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中,，浸泡15-20min.
② 帶上手套，裁剪好濾紙（Whatman,3MM CHR）和NC膜,，濾紙和膜大小為83mm×75mm,，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中,，驅(qū)除留于膜上的氣泡,。
③ 打開轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊*浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上,，海綿上再放置一張浸濕的Whatman,3MM濾紙,。
④ 小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡（用轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕并戴手套以轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕膠面,，小心將NC膜放在膠面上,，從凝膠的一邊開始輕輕放下可避免氣泡，注意一定要戴手套或鑷子接觸膜）,。
⑤用去離子水清洗緩沖液槽,，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上,，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移槽,。
⑥將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液,。
⑦將整個裝置放在磁力攪拌器上并開始攪拌,，連接好轉(zhuǎn)移電極恒壓100V轉(zhuǎn)移90min,，若轉(zhuǎn)移過夜則恒壓30V。
⑧電轉(zhuǎn)完畢后,，將NC膜置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉,，37℃2小時或4℃過夜。

5．免疫檢測
一抗與靶蛋白的結(jié)合
① 封閉的膜用PBST漂洗2-3次,。
② 將加樣槽洗滌干凈,，用蒸餾水潤洗，晾干,，將膜用一次性手套覆蓋好,，按標(biāo)記和實驗設(shè)計切下膜條（一般為3 mm寬左右）按順序置于加樣槽中，作好實驗記錄,，加入相應(yīng)的一抗約1ml,，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
③ 室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜,。
④ 棄去一抗,，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST,，上搖床洗滌洗滌5-10min ,，換液，反復(fù)4次,。
  酶標(biāo)記二抗與一抗的結(jié)合
① 根據(jù)實驗需要和設(shè)計選擇合適的酶標(biāo)二抗和稀釋濃度（用含0.5%脫脂奶粉的PBS稀釋）,，每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4℃過夜，注意保證膜的所有部分同溶液接觸,。
②棄去二抗,，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST,，上搖床洗滌洗滌5-10min ,，換液，反復(fù)4次,。

顯色反應(yīng)（注：二抗一般有兩種常用標(biāo)記酶,，HRP和AP，其相對應(yīng)的顯色底物試劑盒為DAB和BCIP/NBT）
① HRP標(biāo)記二抗顯色
   用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）顯色,，按順序依次加Tris Buffer 3滴,，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光,，混勻,，將膜加入顯色液中避光顯色15 min左右終止反應(yīng)，記錄實驗結(jié)果,，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標(biāo)記二抗顯色
   用AKP緩沖液洗膜5min,，棄去AP緩沖液,，加入顯色液（66µlNBT溶液同10mlAKP緩沖液充分混合均勻后加入33µl BCIP溶液1h內(nèi)使用），室溫下顯色（37℃可加速反應(yīng)）,，顯色反應(yīng)通常在30min內(nèi)可完成,。用20mM EDTA/TBS洗膜終止反應(yīng),記錄實驗結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存,。反應(yīng)溶液可預(yù)先配置,，可在4℃儲存一年以上。

三,、說明
1．        WB對照系統(tǒng)
陽性對照：有標(biāo)準(zhǔn)品,，或陽性血清、陽性上清,。
陰性對照：測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清,，測培養(yǎng)上清，用無克隆培養(yǎng)上清,。
空白對照：不加一抗,，用1%BSA代替。
無關(guān)對照（替代對照）：用無關(guān)項目一抗,，或無關(guān)項目的抗體,。
2.切割膜時，大小一般為3-5mm,一抗的體積為每條膜保證1ml,。
3.KSHV,、MCMV,、HCMV項目測血時，血清稀釋度為1:500-1:1000,。
4. KSHV,、MCMV、HCMV項目WB鑒定時,，一抗如為IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如為IgM型,，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。
5.多肽項目WB鑒定,，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562,。