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NK 細(xì)胞因子法體外培養(yǎng)的方法
閱讀：742 發(fā)布時(shí)間：2018-9-20Nk 細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞,，是人體內(nèi)抗癌活性強(qiáng)的免疫細(xì)胞之一,，它在骨髓中發(fā)育成熟后，主要存在于外周血,、肝臟,、腹膜腔和胎盤中，在遇到腫瘤病變細(xì)胞時(shí)就會(huì)把它們殺死,，同時(shí)也會(huì)刺激身體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)，所以被醫(yī)學(xué)界稱為「抗癌的道防線」,。
NK 細(xì)胞主要分布于外周血,，占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的 5-10％，無需抗原提呈細(xì)胞作為中介提呈抗原,，也無需抗體幫助,，可直接清除衰老細(xì)胞、變性細(xì)胞、癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等,。NK 細(xì)胞屬于白細(xì)胞的一種,，它是人體忠誠的衛(wèi)士，主要任務(wù)就是消滅那些已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞,，從而把病毒消滅在「搖籃」中,。另外，身體里面的腫瘤細(xì)胞也是它們追殺的對(duì)象,。
NK 細(xì)胞在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起到非常重要的作用,，是一種有效、安全的腫瘤生物免疫治療方法,，具有廣闊的應(yīng)用前景,。
分離培養(yǎng) NK 細(xì)胞有多種方法，以下是采用某種試劑盒的因子法體外培養(yǎng)方法來培養(yǎng) NK 細(xì)胞：
這種方法采用自體外周血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞,，經(jīng)體外操作使 NK 細(xì)胞擴(kuò)增活化,，通過激活體 內(nèi)特異性免疫反應(yīng)達(dá)到殺火腫瘤細(xì)胞目的的一種體細(xì)胞治療方法。
1. 某 NK 細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包含：
①無血清培養(yǎng)基 2 瓶（l000 mL/瓶）：
②NK 試劑 A, 1 支：
③NK 試劑 B, 1 支：
④NK 試劑 C, 1 支:
⑤NK 試劑 D, 1 支：
⑥NK 試劑 E, 1 支：
培養(yǎng)體系中需用到 2 支（100 萬 IU/支）rH IL-2
2. 原材料
1. 采取外周血（可從臍血,、骨髓等組織）
2. 需的試劑耗材包括：
0.4% 苔盼藍(lán)溶液,、生理鹽水、人淋巴細(xì)胞分離液（建議選用 GE）,、175 cm²培養(yǎng)瓶,、GT-T610（A）培養(yǎng)袋、15ral/50 ml/250 ml 離心管,、移液管,、1 毫升無菌注射器
3.NK 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過程:
前一天：要提前處理好細(xì)胞活化瓶（NK 試劑 A）
第 1 天：進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo) (NK 試劑 B）
第 3 天：NK 細(xì)胞次補(bǔ)液，補(bǔ)液 50 ml（NK 試劑 C）
第 5 天:NK 細(xì)胞第二次補(bǔ)液,，補(bǔ)液 175 ml (NK 試劑 D）
第 7 天：NK 細(xì)胞第三次補(bǔ)液,，裝袋并補(bǔ)液 500 ml (NK 試劑 E)
第 9-10 天：NK 細(xì)胞第四次補(bǔ)液，分袋并補(bǔ)液 750 ml
第 12 天：NK 細(xì)胞第五次補(bǔ)液. 補(bǔ)液 500 ml
第 13 天：檢菌
第 14,、15 天：培養(yǎng)成功
（細(xì)胞培養(yǎng)成功時(shí)間視具體細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定,，在保持培培養(yǎng)基 ph 和細(xì)胞活力正常的情況下也可以多培養(yǎng)一天）
4. 具體操作步驟如下：
1. 頭一天一定要先處理細(xì)胞活化瓶。
2. 將 NK 試劑 A（4 度保存）加入到含有 12.5 ml 生理鹽水的 175 cm²底面積細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，充分的混勻 30 秒-1 分鐘, 使液體充分在瓶底分散,，4 度冰箱平放過夜。
(NK 試劑 A 需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底,；次日取出后直接吸棄液體即可,，無需清洗)
3. 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)（第 1 天）
4. 以 100 ml 外周血為例，如血量不同,，也可按操作規(guī)程做相應(yīng)調(diào)整,。
5. 將患者外周血,，用移液訝吸取少許原血（約 300 ul）劃線或滴入平皿過行檢菌。然后,，正常室溫下, 進(jìn)行離心,。
6. 將上層血漿轉(zhuǎn)入離心，滅活,，離心,，取上清液備用。
7. 使用等體積的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀混勻后,，小心加到 Ficoll 層上,，使分層保持清晰。室溫內(nèi)進(jìn)行離心,。
8. 吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC）層,，盡量吸盡兩液面交接處的細(xì)胞層. 加生理鹽水吹打混勻，離 心,。相同方法冉次洗滌細(xì)胞,。
9. 棄去上清后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù),。
10. 按照細(xì)胞密度為 1-2*10^6 個(gè)/ml(優(yōu)為 5 *10^6 個(gè)/ml）, 用培養(yǎng)基清洗離心管,，并入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并加入 1 支 NK 試劑 B,，患者滅活血漿 1.25 ml (5%）確保培養(yǎng)基終體積為 25 ml 左右,。剩余血漿 4°C 密封保存?zhèn)溆谩?br />注：包被瓶取出時(shí)間為細(xì)胞加入前 5 分鐘, 其他時(shí)間需在 4 度放置備用。
試劑 A,、B,、C、D,、E 的取用. 違議次吸取原液后. 以適貴培養(yǎng)基沖洗西林瓶后再吸出,，以大程度減少損耗。
11. 活化培養(yǎng)基的配置：其中 1 瓶無血清培養(yǎng)基中,，加入 100 萬 IU 的 IL-2,，終濃度為 1000IU/mL。
注：活化培養(yǎng)基每次使用前恢復(fù)至室溫,。
12.NK 細(xì)胞的補(bǔ)液（第 3 天）,，補(bǔ)加含有 5% 的患者滅活血漿和 NK 試劑 C，確保培養(yǎng)的終體積為 75 mL,。(請(qǐng)勿吹打細(xì)胞)
13.NK 細(xì)胞的第二次補(bǔ)液（第 5 天）,，補(bǔ)加含有 5% 的患者滅活血漿和 NK 試劑 D, 確保培養(yǎng)的終體積為 250 ml.（請(qǐng)勿吹打細(xì)胞）
14.NK 細(xì)胞的第三次補(bǔ)液及其裝袋（第 7 天），細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞,，切勿劇烈吹打,，隨后將培養(yǎng)瓶的中的細(xì)胞懸液及其 500 mL 活化培養(yǎng)基，裝入到細(xì)胞培養(yǎng)袋中,，同時(shí)加入 1 支 NK 試劑 E,，及其剩余的全部血漿，確保終體積為 750 ml,。
15.NK 細(xì)胞的第四次補(bǔ)液（第 9 天）,，主要為分袋操作，將培養(yǎng)體系由 750 ml 擴(kuò)增至 1500 ml,。
16.NK 細(xì)胞的第五次補(bǔ)液（第!2 天）. 主要為補(bǔ)液操作,，將剩余的 500 mL 擴(kuò)增液均分到 2 個(gè)培養(yǎng)袋中，確保每袋體積為 1000 ml,。
17. 檢菌,，細(xì)胞培養(yǎng)第 13 天，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行檢菌,、內(nèi)毒素檢測(cè),。用 5 ml 注射器分別從培養(yǎng)瓶和袋內(nèi)抽取少細(xì)胞懸液，加入正置的平皿中,，放入 35℃ 恒溫生化培養(yǎng)箱,， 記錄放入日期及培養(yǎng)物品。隔夜后倒置,，保留 48 小時(shí),。
18. 收獲，正常情況下,，第 13, 14 天各收獲 1000 ml 細(xì)胞懸液,。若因臨床需要進(jìn)行提前或延遲回輸，也可相應(yīng)提前或延遲,。（NK 細(xì)胞建議 2-4 h 之內(nèi)使用,，以保證其活性）