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細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的特點及檢驗的筆記
閱讀：529 發(fā)布時間：2018-8-14近看大家常提到支原體污染,，就翻了翻書,，做了些筆記,，現(xiàn)在貼出來和大家分享：
支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨立生活的微生物,。約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性,?？蔀閳A形、絲狀或梨形,。
支原體形態(tài)多變,，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu),。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束,。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間,。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小,，且中央無顆粒群
或中央束,。
支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸,、O2或葡萄糖,，每一種支原體都有自身持點。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6-8．0),，對酸耐受性差,。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感,。
支原體污染細(xì)胞后,，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著,，細(xì)微變化也可由于傳代,、換液而緩解，因此易被忽視,。但個別嚴(yán)重者,，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落,。
為確定有無支原體污染可做如下檢測：
①相差顯微境檢測：將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出,，用相差油鏡觀察,，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。
②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258,，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色,，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上,，在細(xì)胞未長滿前取出玻片,，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min,，然后用生理鹽水漂洗,，置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min,，向細(xì)胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴,，然后置熒光顯微鏡下觀察,。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點。
③電鏡檢查,；用掃描電鏡方法簡便快速,，也可以利用透射電鏡。
④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高,，但方法較為復(fù)雜,。
支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之間,，呈高度多形性,，有球形、桿形,、絲狀,、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞,，也不同于病毒,。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺,，革蘭染色為陰性,。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長，營養(yǎng)要求比細(xì)菌高,。
細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個世界性問題,。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá),，又不能通過可視法對其進(jìn)行檢測,，而且它對細(xì)胞的生長率影響較小，不易引起注意,。國內(nèi)外研究表明,，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）,、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）,，為牛源性。以上是常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群,，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的,，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞,，有的細(xì)胞株可以同時污染兩種以上的支原體,。
支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）,、培養(yǎng)基的污染,、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染,、實驗器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。
組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中,，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染,；嚴(yán)格實驗操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌,；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素,。支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株,，有必要清除支原體,，常用方法有抗生素處理、抗血清處理,、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理,。支原體突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講,，對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素,，如 β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等*不敏感,；對多粘菌素（polymycin）,、利福平、磺胺藥物普遍耐藥,。對支原體有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類,、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類,、氯霉素對支原體有較小抑制作用,，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。
InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體,，不影響細(xì)胞本身的代謝,，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞，不會重新感染支原體,。