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小鼠胚胎成纖維細胞MEF培養(yǎng)相關知識總結
閱讀：1173 發(fā)布時間：2018-8-9小鼠胚胎成纖維細胞的富集
1,、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當鼠麻醉后,，實施斷頸法處死小鼠,。
2、用70％乙醇擦拭腹部,，把皮膚向后拉,，暴露出腹膜。用消毒過的工具,，剪開腹壁以暴露出子宮角,。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍,。
3,、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。
4,、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開,，分離后切除內臟（所有深色的東西）。將胚胎轉移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍,。
5,、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當你剪的很累以致于不能再剪的時候,，加入2ml胰蛋白酶/EDTA繼續(xù)剪,。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大約20分鐘,。此時,，返回至步，對下一只鼠進行操作,。
6,、執(zhí)行1－4步，到將胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中這一步,。
7,、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的組織物殘留,。將皿放回培養(yǎng)箱再孵育10分鐘,。
8、用20ml培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶/EDTA的消化,，將皿中的物質轉移至50ml錐形管中,。
9、混勻管內的物質,，加入到含有20ml培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中,。每個培養(yǎng)瓶中裝大約3個胚胎。
10,、將這些培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。
11,、將胚胎置于PBS中,，并重復第5步。
12,、第二天更換培養(yǎng)基,，以去除碎片和中毒的細胞及其分泌的物質。
13,、當培養(yǎng)瓶中的細胞長到80-90%匯合時并仍處于指數(shù)生長期時,，是凍存細胞的時期。一般說來,，這發(fā)生在準備胚胎的第二天,。這可能或早或晚發(fā)生，所以請注意觀察你的培養(yǎng)瓶。
注釋：
我們已用CF－1品系的鼠制備了成纖維細胞,。
培養(yǎng)基成分：
88％ DMEM
10％ FBS
1％ NEAA
1% 雙抗
對于新建立的細胞系,，要對樣本進行支原體檢測。
小鼠胚胎成纖維細胞的消化/傳代
1,、移去MEF培養(yǎng)基
2,、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3,、每個培養(yǎng)瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶）,，消化5min。
4,、為了使細胞分散開,，輕輕吹打細胞。
5,、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA,，加入至少1ml的MEF培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。
6,、將細胞懸液加入到15ml的錐形管中,，吹打幾次，使細胞分散為單個的,。
7,、在新的T75培養(yǎng)瓶中加入10mlMEF培養(yǎng)基。
8,、將細胞懸液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中,，放在37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
注釋：
MEF培養(yǎng)基成分：
89% DMEM (Gibco # 12100-046)
10% FBS (Gibco # 16000-044)
1% NEAA (Gibco # 11140-050)
MEF每傳一代就會生長得更慢些,。你次傳代的比例可以是1:5,，但是后一次的傳代（第4代或第5代）比例應該是1:2。
小鼠胚胎成纖維細胞的凍存
重懸培養(yǎng)基：
80% DMEM
20% FBS
1% NEAA
凍存培養(yǎng)基：
60％ DMEM
30％ FBS
20％ DMSO
1,、用不含鈣鎂離子的PBS洗一次細胞,。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大約5min,。
3,、將細胞吹打下來。
4,、加入與胰蛋白酶/EDTA等體積的培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化,。
5、吹散大塊組織,。如果還有大塊組織存在,，可將懸液加入到50ml的管中使其沉淀,。
6、取上清液,，將其分裝到錐形管中,，1000rpm離心5min。
7,、每個凍存瓶中加入0.5ml（凍存液的一半體積）的重懸培養(yǎng)基重懸細胞,。
8、逐滴加入等體積的（0.5ml/瓶）凍存培養(yǎng)基,，混勻?，F(xiàn)在DMSO的濃度是10％。
9,、每個凍存瓶中加入1ml的細胞,。
10、迅速將細胞轉移到凍存的容器中,，-70℃凍存過夜,。（細胞不能長時間放置在室溫而含有DMSO的情況下）
11、第二天將細胞放于液氮中長期保存,。
注釋：
提前標注好凍存細胞的以下信息：
細胞系名稱
傳代的代數(shù)
凍存細胞的數(shù)目
日期
Initials
注明凍存/解凍形式
小鼠胚胎成纖維細胞的解凍/復蘇
1,、將凍存瓶從液氮中取出。
2,、放在37℃水浴中快速解凍,，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.
3、當僅還有一點冰晶殘留時,，用95％的乙醇消毒凍存瓶的外面,，并將其置于hood中。（為什么用95％的乙醇消毒,？hood是什么,？）
4、輕輕地上下翻轉細胞一次,，將它們放入15ml錐形管中,。
5、想管中逐滴加入10ml培養(yǎng)基,。這一步操作不能少于兩分鐘。做快了對細胞將是一種打擊,，你將得到比其他方法具有更低生活能力的細胞,。
6、1000rpm離心5min,。
7,、將細胞重懸于10ml培養(yǎng)基中,，然后放入T75培養(yǎng)瓶中。
8,、放入37℃培養(yǎng)箱,。
9、注明凍存/解凍的形式,，以更新數(shù)據(jù),。
網(wǎng)友觀點是：
1、關于如何確底胚胎期12.5d~13d的小鼠,？希望大家能夠介紹一下自己所采用的方法,，集思廣益。我所采用的方法是選擇同一天出生的三對小鼠,，到成熟（8~10 w）后,，分三周合籠，（每周合籠一對）,，然后待早合籠的小鼠產崽后,，再取另兩個雌鼠的胚胎。不知道這樣行不行,，也沒注意別人是怎樣做的,。另外問了幾個外科的同學也沒找到可以查出小鼠孕期的儀器。
2,、關于提取MEF的比較好的protocol
3,、關于MEF轉染時起耐受性如何？這個我以后主要做這些,，可能會積累一定的經(jīng)驗,，但現(xiàn)在肯定有各位朋友已經(jīng)從事或正在從事著方面的工作，希望能夠分享經(jīng)驗,。
4,、關于其分泌細胞因子能力？我從一些文獻上發(fā)現(xiàn),，MEF除了作為胚胎干細胞的飼養(yǎng)層以外,，也是研究天然免疫的重要材料，如日本東京大學的 AKIRA的實驗室,，大板大學的takashi fujita實驗室就發(fā)了相當多的文章,。從這些文獻可以看出，MEF分泌細胞因子能力遠遠強于HEK293等工程細胞,，相當于肝實質細胞,，略低于幾種免疫細胞。但較免疫細胞,，我認為有其不可替代的優(yōu)勢：
（1）其并不是主要發(fā)揮免疫功能的細胞,，只有在受到外界刺激時才會應答,，分泌細胞因子，免疫細胞在不受刺激時也會為了維持穩(wěn)態(tài)而不斷產生細胞因子,，即使有嚴格的control 組,，但專門的免疫細胞即使是同一種細胞（DC，NK,，T）但不同的細胞分泌細胞因子的能力也是參差不齊的,。會造成control 相對不一致。
（2）另一方面,，由于這些免疫細胞大部分都是懸浮的,，不太容易轉染，結果陽性率也會較低,。
（3）現(xiàn)在的分離MEF的方法很便宜,，不復雜，而分離純的免疫細胞（如NK,，DC），需要MACS,，F(xiàn)ACS等,，這對目前國內的實驗室經(jīng)費相對緊張的情況來說，不是很劃算,。因此除非是需要研究某一種免疫細胞,，如果是為了研究天然免疫或者adaptive immune過程中某中基因,，或者蛋白,，或者某一信號通路等的作用，MEF 細胞不失為一種選擇,。
網(wǎng)友觀點：
1、我每次取的是16~18天的胚鼠 個人覺得無礙 我倒更喜歡大一點的胚胎 更好操作一點
2,、我取的是皮膚 然后胰酶4度消化過夜 第二天終止消化 撕掉表皮 留下 減碎 用的100目濾網(wǎng)過濾 這個胰酶消化的時間是個關鍵 時間長了 細胞容易死 時間少了，表皮不容易揭下來 我有此就是這樣 消化了15個小時 結果接種下來的細胞不能貼壁 全死了
3,、我用的培養(yǎng)液是DMEM+10%小牛血清 培養(yǎng)液也是關鍵 因為雖然都是成纖維細胞比較潑辣 但總歸是原代 可能還是比較嬌嫩 我前幾天就是這樣 后來發(fā)現(xiàn)是培養(yǎng)液出的問題 測的PH值都8.3了 細胞不死才怪 畢竟細胞耐酸不耐堿
4、原代培養(yǎng)的大天敵還是污染
網(wǎng)友觀點：
MEF對培養(yǎng)基和血清的要求不高,，一般的都行我用過高糖DMEM和D/F-12,，生長情況都行,，而且看不出什么差別。血清也是以前用幾百塊錢的國產標準胎牛血清也長得也不錯,，因為要養(yǎng)干細胞,，所以現(xiàn)在換成進口Gibco胎牛的血清（兩千多/500ml）,，感覺細胞的狀態(tài)確實好了一些,。我的血清濃度一般是16.66666%,。
網(wǎng)友觀點：
細胞沒別的，就是很容易老化,，一般我都是1:5~1:3傳代,，3代之后細胞就出現(xiàn)衰老了,，我感覺年輕增殖能力強的MEF應該有著清晰的細胞輪廓,，細胞立體效果不錯，在相差顯微鏡下,，細胞核清晰,，細胞纖長,，正在分裂或是剛剛分裂的細胞沒有伸出偽足,，但是同樣有著更加明亮的輪廓,，與細胞邊緣相比,，細胞呈深色（我覺得是透光效果不好）,。一般在4×下觀察能看出細胞的狀態(tài),，此時能看到細胞呈梭形或是三角形,。細胞鋪展很厲害,，細胞的透光效果增加，說明開始衰老,。衰老的MEF不要做feeder,但是也不是*不好,。但是要是做轉染或是感染的話，出現(xiàn)衰老的MEF就不行了,。所以一般就是3代以內做,。
我們用的就是WiCell的protocal養(yǎng),，和前面那位戰(zhàn)友發(fā)的差不多。只是我們用1mg/ml Collengase IV消化40min,，用什么酶不重要,，我覺得重要的就是種盤后的換液。原代2小時不管還有多少米貼都不要,，傳代復蘇后一小時就換,。消化的時候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO),，5min消化不下來的也統(tǒng)統(tǒng)不要,。因為健康的MEF就是易消化易貼壁,。老化以及混雜的其他細胞（神經(jīng)、上皮）就沒那么快了,。
附帶一句,，易消化易貼壁是fibroblast的共性。