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原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)凋亡
閱讀：489 發(fā)布時(shí)間：2018-8-8（一）原理
凋亡細(xì)胞是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈DNA段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)（缺口）,，暴露出大量3-羥基末端,，如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標(biāo)記的dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記，則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞,。主要應(yīng)用的是熒光標(biāo)記法和酶標(biāo)記法,。
（二）熒光標(biāo)記法
1．材料與試劑 采用德國Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 試劑盒，或美國Oncor公司ApopTagTM試劑盒,，包括：
⑴生物素標(biāo)記的-Dutp(Biotin-dUTP)或標(biāo)記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)１nmol/µl
⑵ TdT酶（25U/μl）
⑶ 反應(yīng)緩沖液
⑷ 洗滌緩沖液
⑸ 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的親合素或鏈霉親合素（2.5µg/ml）或抗抗體（1︰30）
⑹ PI染液（含PI 5µg/ml及無DNA酶活性的RNA酶0.1%）
⑺ PBS緩沖液
⑻ 塑料蓋玻片
2.樣品
⑴ 懸浮生長培養(yǎng)細(xì)胞的甩片或涂片
⑵ 貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞
⑶ 冰凍切片
⑷ 常規(guī)石蠟切片
3.操作方法
（1）固定：培養(yǎng)細(xì)胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后,，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定,、石蠟包埋之切片進(jìn)行脫蠟,、水化。
（2）洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min,三次,。
（3）反應(yīng)：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍水分,，按50μl/㎝2滴加反應(yīng)液（每50μl反應(yīng)液含TdT酶0.5μl,標(biāo)記的-dUTP 1μl）,使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細(xì)胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h。
（4）終止反應(yīng)：去掉塑料蓋玻片,，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi),，洗滌兩次，每次5min,。
（5）FITC標(biāo)記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細(xì)胞或組織周圍水分,，按50μl/㎝2滴加FITC反應(yīng)液（含F(xiàn)ITC 2.5μg/ml），室溫下避光孵育10min,。
（6）洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi),，洗兩次，每次5min,。
（7）PI復(fù)染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi),，室溫下避光染色30min。
（8）封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上,，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣,，置暗盒中，盡早鏡檢觀察,。
4.結(jié)果判定：用熒光顯微鏡觀察,，選用藍(lán)色激發(fā)光（波長488nm），所有的細(xì)胞核均被PI著色,，顯示出紅色熒光,，而凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上FITC，顯示出黃綠色熒光,。
(三)酶標(biāo)記法
1.材料與試劑 采用美國Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase試劑盒,，包括：
⑴ 過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體
⑵ 反應(yīng)緩沖液
⑶ TdT酶
⑷ 反應(yīng)終止/洗滌液
⑸ 平衡緩沖液
⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。
⑺ 30% H2O2
⑻ DAB顯色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS,，用前過濾并加入
0.02% H2O2,。
⑼ 甲基綠染液：0.5%甲基綠溶于0.1Mol/L枸櫞酸鈉，pH調(diào)整到4.0,。
⑽ 塑料蓋玻片及玻璃蓋玻片
2．樣品 同熒光標(biāo)記法。
3．操作方法
⑴ 固定：同熒光標(biāo)記法,。
⑵ 內(nèi)源性過氧化物封閉 玻片置于盛有0.5% H2O2緩沖溶液的染色缸內(nèi),，室溫下作用20min后，同熒光標(biāo)記法洗滌,。
⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸,，室溫下消化15min，洗滌
同上。
⑷ 平衡處理：將細(xì)胞或組織周圍液體用吸水紙吸干,，滴加平衡緩沖液（按70µl／cm2）覆蓋細(xì)胞或組織表面,，蓋上塑料蓋玻片，室溫下作用5min～10min,。
⑸ 反應(yīng)：移去蓋玻片,，傾去平衡液，用吸水紙吸干周圍液體,，滴加反應(yīng)液（按50µl/㎝2,，18μl TdT酶 36μl反應(yīng)緩沖液），均勻覆蓋在細(xì)胞或組織上,，蓋上塑料蓋玻片,，置于濕盒中，37℃溫育1h,。
⑹ 終止反應(yīng)：移去蓋玻片,，將玻片置于盛有終止/洗滌液的染色缸內(nèi)，37℃下洗滌30min（置搖床上振搖）,。然后將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi),，洗兩次，每次5min,。
⑺ 抗體反應(yīng)：用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍液體,，滴加70μl過氧化物酶標(biāo)記的抗體，均勻覆蓋,，加上塑料蓋玻片,，室溫下置于濕盒中，孵育30min,。
⑻ 洗滌：置于洗滌緩沖液內(nèi),，洗兩次，每次5min,。
⑼ 用吸水紙吸干細(xì)胞或組織周圍液體,，滴加新鮮配制的DAB顯色液，均勻覆蓋,，加上塑料蓋玻片,，室溫下作用3min～6min。
⑽ 洗滌：置于蒸餾水中洗滌3次,，每次3min～6min,。
⑾ 套染：將玻片置于盛有甲基綠染液的染色缸中，室溫染色10min,。
⑿ 洗滌：蒸餾水洗滌3次（置于搖床上）,，每次2min,。
⒀ 脫水、封片：100%正丁醇,，3次,，每次2min。二甲苯,，3次,，每次2min。
明膠甘油封片,。
4．結(jié)果判定 光學(xué)顯微鏡下觀察,，所有的細(xì)胞核均著綠色，凋亡的細(xì)胞核染色質(zhì)顯示出特異性的棕黃色,。
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