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檢測細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)方法比較
閱讀：4162 發(fā)布時(shí)間：2018-8-8TUNEL 與 ELISA檢測凋亡的方法比較
TUNEL法
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶,、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）,。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成,，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片,、冰凍組織切片,、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用.
ELISA法測細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡時(shí),，Ca2+,Mg2+離子依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區(qū)裂斷，產(chǎn)生單或寡合苷酸小體，各核小體的DNA與核組蛋白H2A,H2B,H3,H4形成緊密的復(fù)合物而對內(nèi)源性核酸酶有抵抗使之不被內(nèi)源性核酸酶裂解,。主要使用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白,。
◆ 幾種檢測凋亡的方法
一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1,、HE染色,、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染,，胞質(zhì)濃縮,，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象,。
2,、丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光,，胞質(zhì)呈紅色熒光,。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體,。
3,、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂,，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞,，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死,。如果細(xì)胞膜完整,，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞,。此方法對反映細(xì)胞膜的完整性,，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
4,、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失,，核染色質(zhì)固縮、邊集,，常呈新月形,，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí),，細(xì)胞器集中,，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
二,、DNA凝膠電泳
（一）,、檢測原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA斷增加,，高分子DNA減少,，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,，出現(xiàn)180－200bpDNA斷,，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡,，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別,。
（二）結(jié)果判斷
正常活細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER)條帶,；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶,。
三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體,。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA斷組成,，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1,、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心,，其上清液中含有核小體；
2,、在微定量板上吸附組蛋白體’
3,、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
4、加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
4,、加酶的底物,，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高,，可檢測5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞,。可用于人,、大鼠,、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器,，適合基層工作,，但是不能測定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對量。
四,、流式細(xì)胞儀定量分析
（一）檢測原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加,，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間,。利用這一特點(diǎn)，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞,、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞,。
（二）應(yīng)用價(jià)值
流式細(xì)胞儀檢測具有以下特點(diǎn)：
1)、檢測的細(xì)胞數(shù)量?，因此其窂某群体细胞的迪u鱟刺冉獻(xiàn)既?BR>2),、可以做許多相關(guān)性分析
3)、結(jié)合被檢測細(xì)胞的DNA含量的分析,，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期
■檢測形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),，其細(xì)胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間,，利用這一特點(diǎn),，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞,、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,。
利用Hoechs-PI染色法，正常細(xì)胞對染料有抗拒性,，熒光染色很淺,，凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光,，而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶（PI)而呈強(qiáng)的紅色熒光,。
■DNA斷原位標(biāo)記法
凋亡細(xì)胞DNA斷原位末端檢測技術(shù)是指在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素,、或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3·的羥基（－OH）端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測DNA裂解點(diǎn)的技術(shù),。
DNA段原位標(biāo)記法有二種：
1,、原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation,ISNT)技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端
2,、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（in situ end labelling technique,ISEL),，即TUNEL法，它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3·-OH端,。研究證明,，TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測,，TUNEL更為合適,。
■檢測細(xì)胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法
1、原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細(xì)胞膜外測,。磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,，它于PS具有高度的結(jié)合力,。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細(xì)胞外測的磷脂酰絲氨酸,。故利用對PS有高度親和力的Annexin V,，將Annexin V標(biāo)記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測,，且對PI高染）進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測凋亡細(xì)胞,。
2、結(jié)果判斷：正?；罴?xì)胞Annexin V ,、PI均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V高染,、PI低染,；壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染。
3,、應(yīng)用價(jià)值：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏,。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞,，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA段丟失。因此,，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí),，結(jié)果更為可靠，是目前為理想的檢測細(xì)胞凋亡的方法,。
◆ 幾點(diǎn)參考
1.大部分凋亡細(xì)胞可能并不見得有非常典型的凋亡表型,，如電鏡的染色體邊集、凋亡小體等,，DNA電泳也不見得都有DNA ladder,，但對某些指標(biāo)來說還算穩(wěn)定，如PI染色及TUNEL法,，所以如果某個(gè)方法效果不好,，可以換用其他方法檢測
2.壞死與凋亡的區(qū)分傳統(tǒng)上認(rèn)為是無序與有序的過程，樓上所說的線粒體腫大也是以前的一個(gè)傳統(tǒng)認(rèn)識(shí),，但現(xiàn)在有很多人認(rèn)為壞死的發(fā)生也是有序發(fā)生的,，因此也有了程序化壞死一說，在很大程度上,，由于凋亡是時(shí)間依賴性的過程,，細(xì)胞發(fā)生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期與壞死進(jìn)行區(qū)分是困難的,，而且我認(rèn)為如果不是對于凋亡或是壞死本身通路進(jìn)行研究的話,，強(qiáng)行區(qū)分是沒有意義的
◆細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)與方法
細(xì)胞凋亡（Apoptosis）,，又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程,。它是一個(gè)主動(dòng)的,，高度有序的，基因控制的,，一系列酶參與的過程,。細(xì)胞凋亡概念提出至今還不到30年的時(shí)間，但由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵角色,，對個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用,，引起了人們對其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界為熱門話題之一,，也是生命科學(xué)界乃至社會(huì)各界爭相投入的研究領(lǐng)域,。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導(dǎo)方面的文章遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過位于第二位的人類基因組方面的,，而信號傳導(dǎo)中一個(gè)重要的前沿領(lǐng)域就是細(xì)胞凋亡的研究,。隨著這方面研究的持續(xù)升溫，涌現(xiàn)出了大量新的技術(shù)和方法對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測,，其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現(xiàn),，大大加速了研究的進(jìn)程。具體來說,，針對凋亡的不同階段有以下一些方法（概括如圖1）：
1． 早期檢測:
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測:
PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志,。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS,，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用）,，可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段,。
美國生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速,，10分鐘就可完成檢測,。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高,，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ),。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1,，還可進(jìn)行定量檢測,。除此之外,，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來檢測,。另外,，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞,。
2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：
這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對較新的趨勢,，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MC 體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化,。
正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑,。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原,。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要,，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中,，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng),。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí),，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中,，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng),。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測除了對研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外,，還可用于心臟病,、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒有明顯的GSH水平的變化,，不能用此法檢測,。
3）細(xì)胞色素C的定位檢測
細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用,。正常情況下,，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液,，結(jié)合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9,，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白,，凋亡發(fā)生時(shí),，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志,。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心,，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分,，再進(jìn)一步通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生,。
4) 線粒體膜電位變化的檢測：
在凋亡研究的早期,，從形態(tài)學(xué)觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入,，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分,，發(fā)生很多生理生化變化。例如,，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變,。MitoSensorTM,，一個(gè)陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感,，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中,，它在線粒體中形成聚集體,，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中,，因線粒體穿膜電位的改變,，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光,。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號,。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是,，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化,。
2． 晚期檢測：
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA,，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA段,。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：
1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過）或直接接到DNA段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果,。美國Intergen公司提供多種標(biāo)記方法,，直接熒光標(biāo)記，介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過氧化物酶聯(lián)顯色,，可做細(xì)胞懸液,、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測,。其中,，直接標(biāo)記步驟少,，操作簡便。而間接標(biāo)記有信號放大的作用,，檢測靈敏度高,。
2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測)
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化,。CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭,，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段,。此外,，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較,。
上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征,，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象,，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會(huì)受到其它原因的干擾,。
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法,。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白,，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”,。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的,，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短,，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘,，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號,。研究發(fā)現(xiàn),，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年推出,。它提供特定的寡核苷酸底物,，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性,，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列,，通
過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）,。此外,，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,。
3．mRNA水平的檢測
研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因,，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道,，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞,。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活,。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進(jìn)行檢測,。隨著近年來熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確,。Intergen公司的Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理,，通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。
以上介紹了針對凋亡不同階段特征的檢測方法,，隨著凋亡機(jī)制研究的深入,，近年來還發(fā)展了許多針對特定的凋亡途徑的檢測，如抗體法,，酶活性測定等等，Cell Signeling technology公司,，DAKO公司,，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流,，開發(fā)了大量的抗體及活性測定產(chǎn)品,。
隨著對細(xì)胞凋亡的研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入，對包括腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本的細(xì)胞凋亡的檢測已成為一種迫切需要,。目前,，多種方法已得到較廣泛的應(yīng)用。然而如何選擇適當(dāng)?shù)姆椒úz測的結(jié)果作出正確的判斷及愉如其分的解釋仍是值得探討的問題,。本文簡要評述幾種常用的細(xì)胞凋亡檢測方法,。
◆
一、 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察
細(xì)胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根據(jù)某些單個(gè)細(xì)胞死亡時(shí)細(xì)胞碎裂如花瓣或樹葉散落般的形態(tài)學(xué)特征,。目前對細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)正不斷得到深化,，檢測凋亡細(xì)胞的方法也逐漸增多，但形態(tài)改變?nèi)允谴_定細(xì)胞凋亡的可靠的方法,。
光學(xué)顯微鏡觀察
凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染,，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂,。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小,，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體,。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在,，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng),。本方法簡便易行,，但在細(xì)胞密集的組織中對于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo),，具有較強(qiáng)的主觀性,，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察,，作為分析指標(biāo)之一,。
檢測方法：細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變,，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù),。
視頻時(shí)差顯微技術(shù)（video time-lapse microscopy）
本方法用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞凋亡的變化過程,，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化,。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓,、收縮,、出泡，有的細(xì)胞拉長,，出現(xiàn)釘狀突起,，特續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解,，通過連續(xù)觀察,，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細(xì)胞，但不能用于病理組織,。
檢測方法：收集2×105細(xì)胞/ml培胞,，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導(dǎo)劑,，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變,，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時(shí),。如同進(jìn)進(jìn)行熒光染色,，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
電子顯微鏡觀察
關(guān)于凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征,，包括透射電鏡和掃描電鏡下的改變,，在許我文獻(xiàn)中已有詳盡描述,。凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變?nèi)绨|(zhì)的固縮，染色質(zhì)濃縮成半月形或帽狀附于核膜,，核的碎裂和凋亡小體形成等,，在透射電鏡下得到好的體現(xiàn)。為凋亡細(xì)胞判定提供了可靠的依據(jù),。本方法的缺點(diǎn)是樣品制作過程較復(fù)雜,，且儀器、設(shè)備的費(fèi)用昂貴,，較難廣泛大量開展,。由于樣品范圍局限，在凋亡細(xì)胞數(shù)較少時(shí)需進(jìn)行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變,。還應(yīng)指出的是,，在觀察體外培養(yǎng)的凋亡細(xì)胞時(shí)，?？梢姷礁麟A段的改變,，并可見到較多典型的凋亡細(xì)胞時(shí)，?？梢姷礁麟A段的改變,，并可見到較多典型的凋亡小體很少見到，出現(xiàn)較多的是凋亡初期胞體收縮,、染色質(zhì)邊聚和后期凋亡小體（或整個(gè)凋亡細(xì)胞）被吞噬和降解的現(xiàn)象,。一些不典型的改變?nèi)菀妆缓雎裕谟^察時(shí)要特別予以注意,。
檢測方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,，丙酮脫水,，環(huán)氧樹脂包埋,，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色,，透射電鏡觀察,。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水,，CO2臨界點(diǎn)干燥,，真空噴金，掃描電鏡觀察,。
流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的,。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息,。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種,，前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性,、顆粒性（granu-larity）有關(guān),。細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡,、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變,。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮,，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂,。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。由于光散射牧場生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo),，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱,。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞,。
細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解,，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降,，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析,，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞,。根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率,。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位,、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞,。
檢測方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗,，固定,，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析,。
二,、細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測定
細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測定包括細(xì)胞表面（細(xì)胞膜）的結(jié)構(gòu)和通透性改變的測定和細(xì)胞核DNA改變的測定。根據(jù)應(yīng)用的范圍,，又可分為細(xì)胞群休和單個(gè)細(xì)胞測定兩種,，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。
碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測
早期死亡細(xì)胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的一個(gè)重要指標(biāo),，凋亡細(xì)胞在進(jìn)入終溶解階段前,，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質(zhì)量大的與DNA結(jié)合的熒光染料（如PI)不能時(shí)入凋亡細(xì)胞內(nèi),，而相對分子質(zhì)量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細(xì)胞攝取,。應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細(xì)胞,，細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342標(biāo)記而不出現(xiàn)PI標(biāo)記的為凋亡細(xì)胞。
檢測方法：獲取11×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液,，先用PI染色,，再行Hoechest3342染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察,。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā),，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍(lán)色（480nm）。正常細(xì)胞藍(lán)色強(qiáng),。早期凋亡細(xì)胞由于DNA的漏出藍(lán)色稍弱并有少量的紅色熒光,，晚期凋亡細(xì)胞紅色熒光加強(qiáng)。壞死細(xì)胞紅色熒光強(qiáng),。
膜聯(lián)蛋白（annexin）V標(biāo)記
正常細(xì)胞的細(xì)胞膜磷脂分布是不對稱的,，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外表面,，這一改變被認(rèn)為是特導(dǎo)性的,，并且可作為凋亡細(xì)胞表面改變的標(biāo)記。PS表面化發(fā)生于凋早期,，其機(jī)制尚不清,，可能是一種導(dǎo)致機(jī)體吞噬凋亡細(xì)胞的信號。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,，對PS具有高度親和力,，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞表現(xiàn)PS結(jié)合，再用顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,，可以觀察凋亡過程中細(xì)胞膜PS的表面化,。結(jié)合PI染色進(jìn)行雙參數(shù)檢測尚能區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞,、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞,。正常細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（-）,，晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（+）,。有研究表明膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記僅有不到三分之一的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)陽性標(biāo)記,，其原因尚不明,。同時(shí)需注意度的是凋亡后期溶解階段，細(xì)胞碎片也可出現(xiàn)明顯的陽性著色,。
檢測方法：1×106細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液,，先后用膜聯(lián)蛋白V--FITC及PI染色，流式細(xì)胞儀分析,，獲得由四個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖（cytogram）,，每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)目就是在檢測細(xì)胞總數(shù)在所點(diǎn)的組份,。左下象限代表正常細(xì)胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（An+PI+）,左上象限代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞（An-PI+）,。用生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V還可以作體內(nèi)試驗(yàn),。將生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V注射小鼠體內(nèi)，30分鐘后處死,，迅速取出要研究的組織置于甲醛內(nèi)固定,，然后，常規(guī)石蠟切片,，脫蠟,、水化，用親和素標(biāo)記的過氧化物酶程程序孵育,，DAB顯色,，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞。
DNA瓊脂凝膠電泳法
細(xì)胞凋亡時(shí),，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下,，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時(shí)表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”,。自Wyllie把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生“梯形帶”與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系以來,，“梯形帶”被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生化指標(biāo)。盡管有報(bào)道指出,，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)典型的形態(tài)改變時(shí)可不伴有核小體間的DNA降解,，對這一指標(biāo)提出質(zhì)疑，本方法仍被廣泛應(yīng)用,。但此方法敏感性不高,，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細(xì)胞群體,，不能用于組織的原位檢測,。
檢測方法：培養(yǎng)細(xì)胞清洗、離心,，加入細(xì)胞裂解液裂解,，高速離心，取上清液用酚/抽提二次,，RNA酶消化,，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進(jìn)行電泳，后在紫外線燈下觀察和攝影,。
DNA裂解的原位檢測
在細(xì)胞水平檢測DNA裂解的原位標(biāo)記技術(shù)已越來越多地被用于組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞,，細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA的裂解,，形成單或寡核小體的雙鏈相對分子質(zhì)量小的片段及在相對分子質(zhì)量大的DNA上形成單的繼裂（缺口,，nick）,。此類斷裂可用生物素、或熒光素標(biāo)記的核苷酸在3`-OH端予以顯示,。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）,，前者使核苷酸結(jié)合于缺口，需要模板存在,，標(biāo)記方法通常被稱為“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸,，不需要模板的存在，其方法被稱為未端記（end labeling）,、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）,。上述方法，尤其是TUNEL的應(yīng)用已很廣泛,，其優(yōu)點(diǎn)是可用于原位標(biāo)記,，可用于病理組織，并可進(jìn)行定量分析,。值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的何等用,，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn) 陽性反應(yīng),。組織或細(xì)胞外理不當(dāng)時(shí)可出現(xiàn)假陽性,。因而，TUNEL等方法對凋亡細(xì)胞的標(biāo)記是選擇性的,。而不是特異性的,，TUNEL或其他DNA裂解原位標(biāo)記的分析應(yīng)結(jié)合陽性細(xì)胞的形態(tài)，尤其是核的特征,，細(xì)胞的分布和有無炎癥反應(yīng),，除外非凋亡的陽性反應(yīng)。
檢測方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟,、水化,，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育,，顯色（辣根過氧化物酶標(biāo)記可用DAB顯色,，堿性磷酸酶標(biāo)可用NBT+BCIP顯色），復(fù)染,，脫水,，封片。凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）,。
凋亡蛋白質(zhì)酶（Caspase）-3及其底物的檢測
凋亡蛋白質(zhì)酶是一類半胱氨酸蛋白質(zhì)酶,，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能,，是近年隨著調(diào)亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子,。迄今已有13個(gè)分子得到命名,，分別為凋亡蛋白質(zhì)酶1-13?；械蛲龅鞍踪|(zhì)-3是被認(rèn)為在多種組織,、細(xì)胞類型中常涉及的凋亡效應(yīng)分子?；罨牡蛲龅鞍踪|(zhì)酶-3僅在凋亡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),，因此，檢測凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細(xì)胞,。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC,，凋亡蛋白質(zhì)酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質(zhì),、AMC,，后者在紫外線激發(fā)下發(fā)出波長為430-460nm的熒光，通過流式細(xì)胞儀或分光光度計(jì)對其強(qiáng)度進(jìn)行定量,，從而測定凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性,。由于醛對凋亡蛋白質(zhì)酶-3的水解活性抑制作用，因此同時(shí)加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質(zhì)酶-3對DEVD-AMC的水解,，不產(chǎn)生熒光,。這樣的抑制試驗(yàn)可作為對照，使凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性分析更有特異性,。但是,，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對活化的凋亡蛋白質(zhì)酶-3亞基的抗體,，通過免疫組化顯示凋亡細(xì)胞,，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。
檢測方法：培養(yǎng)細(xì)胞（也可以預(yù)先作凋亡誘導(dǎo)并在不同時(shí)段收集細(xì)胞）在裂解液內(nèi)裂解,、離心,、去上清液。加入凋亡蛋白質(zhì)酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育,，同時(shí)用不加底物的樣品作對照,，流式細(xì)胞儀檢測，加有底物的樣品釋放出的熒光強(qiáng)度樣對照樣品明顯增強(qiáng),。如加入DEVD-AMC時(shí)再加入DEVD-CHO,，樣品釋放的熒光強(qiáng)度與對照樣品無差異。
凋亡蛋白質(zhì)酶-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是通過水解或滅活一些細(xì)胞關(guān)鍵蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的,，因此檢測凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物的改變也有助于辨認(rèn)細(xì)胞的凋亡,。PARP是個(gè)被認(rèn)識(shí)的凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物，它的相對分子質(zhì)量為116000,，水解后形成相對分子質(zhì)量為85000及相對分子質(zhì)量為25000的兩個(gè)片段,，用運(yùn)載相對分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細(xì)胞是否發(fā)生凋亡,。細(xì)胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質(zhì)酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個(gè)新的抗原表位,，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認(rèn)凋亡細(xì)胞,。另外一種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)肌動(dòng)蛋白（actin）被水解后產(chǎn)生一種稱為“fractin”的片段，在凋亡早期出現(xiàn),，并認(rèn)為與細(xì)胞膜的起泡有關(guān),，可能有助于早期凋亡細(xì)胞的辨認(rèn)?？傊?，隨著對凋亡蛋白質(zhì)酶及其底物的進(jìn)一步研究，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的有助于檢測凋亡細(xì)胞的方法,。
三,、展望
除了以上介紹的幾種較常用檢測細(xì)胞凋亡的方尖，還有一些尚未被列入的檢測方法,，新的方法正將出現(xiàn),。盡管用于檢測細(xì)胞凋亡的方法較多，但形態(tài)學(xué)觀察,，尤其是透射電鏡觀察仍具有不可替代的作用,，只是其應(yīng)用受到一定限制。在細(xì)胞化學(xué)檢測方法中,，迄今沒有任何一種方法具有足夠的敏感性和特異性,，尤其在病理組織中要作出準(zhǔn)確定量分析仍較為因難。在目前情況下標(biāo)本和病變的特點(diǎn),，選擇多種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行綜合檢測,，常可行到較準(zhǔn)確結(jié)果,，同樣重要的是,，要充分理解各種方法的原理及應(yīng)范圍，并對結(jié)果作出合理的分析和判斷,。隨著對細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的深化和有關(guān)技術(shù)的進(jìn)展,，期待更敏感、更特異的方法面世,，這對于病理狀態(tài)（包括腫瘤）中細(xì)胞凋亡的研究將具有重要意義,。
◆ 有關(guān)細(xì)胞爬片
1. 處理細(xì)胞爬片：用滅菌的去離子水將多聚賴氨酸配成0.1mg/ml,處理載玻片過夜即可。用前再用去離子水漂洗一次,，就可直接接種細(xì)胞,！
2. 熱療對細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的誘導(dǎo)
陳必良1，安曉汾2，辛?xí)匝?,，王德堂1,，郭慧玲1（1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，
陜西西安 710032,；2第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,，吉林省 吉林市,，132011）
【摘要】目的 探討腫瘤細(xì)胞（以人卵巢癌細(xì)胞為例）在受熱不同時(shí)間,、不同間隔后細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70表達(dá)的異同；明確人卵巢癌細(xì)胞對熱耐受的敏感程度,。方法 體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910,，制成細(xì)胞爬片。加熱溫度設(shè)為42℃,，實(shí)驗(yàn)分成兩部分：①加熱時(shí)間分別設(shè)為15,、30、60,、90,、120、150min,，加熱后立即固定細(xì)胞,；②將細(xì)胞加熱120 min后，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)溫不同時(shí)間,，收集復(fù)溫后1h,、4h、6h,、12h,、24h、48h,、72h,、96h、120h,、144h后的細(xì)胞爬片固定,。然后將兩組細(xì)胞爬片行HSP70的免疫組化染色，觀察熱療前后HSP70的不同表達(dá),。結(jié)果 未加熱細(xì)胞僅有少量HSP70的表達(dá),，隨加熱時(shí)間延長，HSP70的表達(dá)逐漸增多,；加熱后不同間隔HSP70的表達(dá)不同,，間隔6 h HSP70的表達(dá)強(qiáng)，隨后逐漸減少，5-6天后,，恢復(fù)至未加熱狀態(tài),。結(jié)論 ①溫和加熱時(shí)間過長可誘導(dǎo)HSP70的大量產(chǎn)生，從而使腫瘤細(xì)胞對熱療產(chǎn)生熱耐受作用; ②卵巢癌HO-8910細(xì)胞對加熱有較強(qiáng)的耐受性,。
關(guān)鍵詞：熱休克蛋白70,；免疫組織化學(xué)；熱耐受,；卵巢癌,；
隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，對癌癥的診斷和治療有了長足的進(jìn)步,。高溫治療也稱熱療（hyperthermia,，HT，又叫溫?zé)岑煼ǎ?以其無手術(shù)痛苦,、無術(shù)后并發(fā)癥及無化療及放療帶來的副反應(yīng)而發(fā)展成為癌癥治療的有一種有效方法[1],。高溫可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或者生長抑制，同時(shí)高溫還可提高腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性,，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞對于高溫的敏感性明顯高于正常細(xì)胞,。但在應(yīng)用過程中也發(fā)現(xiàn)，隨熱療重復(fù)次數(shù)的增加,，熱療效果反而下降,，會(huì)出現(xiàn)所謂“熱耐受（thermotolerance）”現(xiàn)象，即第1次加溫可影響第2次加溫的生物學(xué)效應(yīng),。這說明在熱療過程中,，腫瘤細(xì)胞內(nèi)生成了某些物質(zhì)可降低其對熱的敏感性。研究表明[2],，該現(xiàn)象與熱休克蛋白家族尤其與熱休克蛋白70（HSP70）的關(guān)系密切,。本研究利用人卵巢癌細(xì)胞HO-8910受熱后進(jìn)行HSP70免疫組化染色，以了解在該細(xì)胞中HSP70的表達(dá)與加熱之間的關(guān)系,。
1 材料和方法
1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910為分化差的卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞,，由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。HSP70成套免疫組化試劑盒（產(chǎn)品編號 SA2077）及DAB顯色試劑盒（產(chǎn)品編號 ED1022）均購自武漢博士德生物工程有限公司,。
1.2 方法
1.2.1 加熱處理 將細(xì)胞接種于含熱滅活的15%小牛血清及雙抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培養(yǎng)液中,，常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,，細(xì)胞密度為1×105/ml。將1cm×1cm 大小的蓋玻片置于24孔板中 ,，每孔加入1ml的細(xì)胞懸液,，制成細(xì)胞爬片,。12 h后，將24孔板置于42℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行兩種實(shí)驗(yàn)處理：①加熱時(shí)間分別設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn),，即15,、30、60,、90,、120和150 min，加熱后的細(xì)胞即刻用0.01M PBS洗滌2次 ,，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞40 min,，制成細(xì)胞爬片后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫虎趯⒓?xì)胞加熱120 min后,，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)溫不同時(shí)間,，收集復(fù)溫后1,、4,、6、12,、24,、48、72,、96,、120及144 h后的細(xì)胞爬片按照上述步驟處理細(xì)胞固定后備用 。
1.2.2 HSP70表達(dá)的免疫組化染色檢測 將細(xì)胞爬片置于3% H2O2中室溫孵育10 min,，以蒸餾水洗滌后次滴加正常山羊血清封閉液室溫放置20 min,、滴加小鼠抗HSP70的抗體37℃ 1 h、滴加二抗及試劑SABC室溫下各放置20 min,，后以 DAB顯色, 染色時(shí)間統(tǒng)一設(shè)為5 min后終止,。再經(jīng) 蘇木素輕度復(fù)染、常規(guī)脫水,、透明和封片后,，于顯微鏡下觀察并照相。陽性細(xì)胞胞漿/胞核染成棕黃色,。
1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用等級資料的秩和檢驗(yàn)
2 結(jié) 果
① 在42℃條件下,，加熱不同時(shí)間，卵巢癌細(xì)胞HO-8910細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)見表1,。未加熱的細(xì)胞內(nèi)(見圖1A), 有少量的HSP70表達(dá),，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)有極淡的淡黃染色；當(dāng)42℃加溫15 min時(shí),，細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)與正常細(xì)胞相比較無明顯改變,；加熱30 min后 (見圖1 ,，可見胞漿內(nèi)HSP70的染色略增強(qiáng)，但顏色仍較淡,，于胞漿,，但胞漿染色數(shù)量增加；無胞核染色,；加溫60 min時(shí)(見圖1C),，可見胞漿內(nèi)HSP70的表達(dá)增強(qiáng)，表現(xiàn)為胞漿染色加深呈深黃色,，染色細(xì)胞接近100%,，但未見核染色；加溫90 min時(shí)(見圖1D),，胞漿內(nèi)染色進(jìn)一步加強(qiáng)呈棕黃色,，偶爾可見核染色；加溫120 min時(shí)(見圖1E),，胞漿內(nèi)染色表現(xiàn)為明顯的棕黃色,，核染色的細(xì)胞增多；加溫150 min時(shí)(見圖1F),，胞漿內(nèi)呈深棕黃色,，核染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多。
表1 HO-8910細(xì)胞溫和加熱不同時(shí)間的免疫組化染色
組別 例數(shù) 染色分級 胞漿染色的細(xì)胞數(shù) 核染色的細(xì)胞數(shù)
組 10 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第二組 15 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第三組 20 Ⅰ（淡黃色） 80%～90% 0
第四組 20 Ⅱ（深黃色） 100% 0
第五組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 5%
第六組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 10%～15%
第七組 20 Ⅳ（深棕黃色） 100% 20%～30%
※ P<0.05
注：①組為未加熱細(xì)胞,；第二組為42℃加熱15 min,；第三組為42℃加熱30 min；第四組為42℃加熱60 min,；第五組為42℃加熱90min,；第六組為42℃加熱120min；第七組為42℃加熱120min
②免疫組化細(xì)胞染色分級標(biāo)準(zhǔn)——淡黃色Ⅰ級,；深黃色Ⅱ級,；棕黃色Ⅲ級；深棕黃色Ⅳ級
② HO-8910細(xì)胞加熱120 min后,，間隔不同時(shí)間進(jìn)行免疫組化染色,，結(jié)果表明, 加熱后1 h，細(xì)胞染色呈深棕黃色仍保持強(qiáng)陽性（Ⅳ級）,，未見明顯淡化,；加熱后4 h（見圖2A），在所有染色的細(xì)胞爬片中,，細(xì)胞染色表現(xiàn)為強(qiáng)Ⅳ級,，核染色的細(xì)胞約占50%；加熱后6 h,，幾乎維持原水平,；加熱后12 h,，可見胞漿染色有所淡化呈Ⅲ級棕黃色，但核染色未見明顯減少(見圖2 ,；加熱后24 h,，染色程度呈Ⅲ級，染色細(xì)胞數(shù)量仍保持100%,，但胞核染色明顯減少,，(見圖2C)；加熱后48 h,，核染色全部消失,，胞漿染色明顯變淡呈Ⅱ級深黃色(見圖2D)；72 h后,，HSP70的表達(dá)進(jìn)一步減少,，細(xì)胞染色呈黃色（圖 2E），隨后,，細(xì)胞染色每隔24 h即有明顯淡化趨勢,，120 h后，細(xì)胞恢復(fù)至正常狀態(tài),。
3 討 論
腫瘤熱療學(xué)是近20年來迅速發(fā)展起來的一門新興學(xué)科,，為腫瘤患者的治療帶來了一線生機(jī)[3],。在臨床應(yīng)用過程中,，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)對熱的耐受現(xiàn)象，尤其是當(dāng)加熱溫度低于43℃（溫和熱療）或加熱時(shí)間過長時(shí),，更易發(fā)生熱耐受[4],。熱耐受不是細(xì)胞固有的特性、不遺傳,，是一種暫時(shí)現(xiàn)象,，可能是熱療過程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些物質(zhì)降低了其對熱的敏感性。研究表明,，腫瘤細(xì)胞在熱應(yīng)激發(fā)生后,，根本的變化是蛋白質(zhì)譜的改變，表現(xiàn)為合成了一組特殊的高度保守的蛋白質(zhì)——HSP或稱為應(yīng)激蛋白[5],，而正常蛋白質(zhì)合成卻被抑制,。HSP是高熱誘導(dǎo)的一種適應(yīng)性蛋白，屬于一種分子伴侶,，主要功能在于當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),，可糾正新合成蛋白質(zhì)的折疊和空間構(gòu)象錯(cuò)誤，協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì),，抵抗應(yīng)激原引起的變性,，維持生理平衡,，從而降低高熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的眾多成員中,是出色的熱耐受預(yù)測因子[7],。加熱過程中,，伴隨HSP70水平的升高，正常蛋白質(zhì)的合成受到不同程度的抑制,。加溫后半小時(shí)無蛋白質(zhì)的合成,，隨著HSP70的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的生物合成逐漸恢復(fù),，腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制開始啟動(dòng),，從而引起腫瘤細(xì)胞對熱的敏感性下降。
卵巢癌是威脅女性健康的生殖器三大惡性腫瘤之一,，死亡率高,，5年生存率不到50%。由于耐藥及抵抗放療效果的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn),，為卵巢癌的治療帶來了新問題,。隨著熱療學(xué)理論的日趨成熟，已有研究將其應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療[8],。為了更好的將這一理論應(yīng)用于臨床,，有必要了解卵巢癌細(xì)胞對熱療的敏感性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：① 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910在未加熱狀態(tài)下,，即有少量的HSP70表達(dá),，當(dāng)給予溫和加熱（即加熱溫度為42℃）時(shí)，短時(shí)間內(nèi),，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70未見明顯增加,。加熱時(shí)間≥60 min后，尤其是加熱時(shí)間超過120 min后,，HSP70的表達(dá)明顯增加,，表現(xiàn)為隨加熱時(shí)間的延長而胞漿的染色加深，而且核染色陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多,，這一結(jié)果表明細(xì)胞的熱耐受已啟動(dòng),。②當(dāng)細(xì)胞受熱120 min后，停止加熱,，在初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)（1～4 h）,，HSP70的表達(dá)保持加熱當(dāng)時(shí)的水平，4 h后,，HSP70的生成達(dá)高峰,，表現(xiàn)為染色程度強(qiáng),，核染色細(xì)胞數(shù)量多,，說明此時(shí)細(xì)胞對熱的敏感性差,。如再次加熱,，高溫對該細(xì)胞的細(xì)胞毒作用低。此后,，隨著時(shí)間的推移,，HSP70的表達(dá)明顯減少，5～6 d后恢復(fù)至正常水平,。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可看出,，卵巢癌細(xì)胞HO-8910 對HSP70的表達(dá)有一定的時(shí)間依賴性，這也是臨床上腫瘤熱療間隔需3～4 d的原因之一,。此外,，雖然可通過提高加熱溫度來減少HSP70的表達(dá)，但畢竟39℃～42℃的溫度對于人體來說是能夠承受的溫度,，因而,，可考慮通過抑制熱療過程中HSP的生成而提高熱療的效率，國外已有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[9],。
一般而言,，腫瘤細(xì)胞受熱溫度偏低，時(shí)間越長,，越易形成熱耐受[10],。人卵巢癌細(xì)胞HO-8910細(xì)胞在受熱60 min后，就已有明顯的HSP70的表達(dá),，而該細(xì)胞的恢復(fù)過程時(shí)間卻長達(dá)5～6 d,，這就提示我們腫瘤細(xì)胞對加熱有一定程度的耐受性，而且熱耐受因細(xì)胞不同而有不同的表現(xiàn)[11],，因此,，在臨床應(yīng)用過程中需要考慮到這一要素。
◆ 細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡與壞死是兩種*不同的細(xì)胞凋亡形式,，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別,，可以將二者區(qū)別開來,。細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法,。
一,、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測
根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法,。
1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小,、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體,。
貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,、變圓、脫落,。
（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色,、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮,、邊緣化,，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài),。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況,。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI,。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的,，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光,。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml,。
DAPI為半通透性,，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml,。
結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài),；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚,、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊,，產(chǎn)生凋亡小體(圖1),。
3 透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮,。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚,、邊緣化,；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊,，產(chǎn)生凋亡小體,。
二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期,，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力特異性結(jié)合,。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記,，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針,，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,，它不能透過完整的細(xì)胞膜,，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染,。因此將Annexin-V與PI匹配使用,，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。
方法
1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次,，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul,，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul,，避光反應(yīng)5min后,，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）,， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照,。
2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌,、染色和分析同懸浮細(xì)胞,。
3 爬片細(xì)胞染色：同上，后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察,。
結(jié)果 [圖4,、圖5]
注意事項(xiàng)
1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞,。
2. 操作時(shí)注意避光,，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測。
三,、線粒體膜勢能的檢測
線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡,，而線粒體跨膜電位DYmt的下降,，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮,、DNA斷裂）出現(xiàn)之前,，一旦線粒體DYmt崩潰,，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
線粒體跨膜電位的存在,，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123,、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）],、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1],、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低,。
方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM）,，JC-1（1mM），TMRM（100nM）,，37°C平衡30min,，流式細(xì)胞計(jì)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
注意事項(xiàng)
1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性,，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位,。
2． 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合,，降低染料的濃度,，引起假去極化。
四,、DNA斷化檢測
細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder),。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA,，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少,，還可在分離提純DNA后,，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影,，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成,。
1. 大分子染色體DNA段的測定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同,。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí),，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,，DNA像通過彎管一樣,，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此,，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離,。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場,。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中,，直至新的電場軸向重新定向后,，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大,，這種重排所需要的時(shí)間就越長,。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開,。
參考文獻(xiàn) Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測定
方法：收獲細(xì)胞（1′107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C,，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,，4°C過夜?14000rpm′15min?后將沉淀溶解在TE buffer中,，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相,。
結(jié)果：[圖6]
參考文獻(xiàn) Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析
方法：收集細(xì)胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌,，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化,。
結(jié)果：[圖7]
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測少量樣本,，小部分凋亡細(xì)胞,。如臨床活組織檢測。
五 TUNEL法
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下,，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）,。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,，因而沒有3'-OH形成,，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片,、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定,，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
六,、Caspase-3活性的檢測
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能,。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中,，在凋亡的早期階段，它被激活,，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成,，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞,，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,，PARP]等的裂解。
方法：
收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉,，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次,，5~10min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色,。
結(jié)果：[圖8-1,、圖8-2]
2 熒光分光光度計(jì)分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵,。根據(jù)這一特點(diǎn),，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí),，AMC不能被激發(fā)熒光,，短肽被水解后釋放出AMC,，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小,，可以測定caspase-3的活性,，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞?PBS洗滌?制備細(xì)胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應(yīng)1h?熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長380nm,，發(fā)射光波長為430-460nm）。
結(jié)果：[圖9]
3 流式細(xì)胞術(shù)分析
方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應(yīng)1h?UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度,。
結(jié)果：[圖10]
七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新基因,，前期的功能研究表明,，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針,，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn),，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化,，持續(xù)較長時(shí)間,，在凋亡小體中仍然可見。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化,，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明,，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義,，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件,，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo),。
（一）TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析
材料試劑：
FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 ,、0.15Mol/L PBS,，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 ,、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20）,，胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 ,、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 ,。FACS管，Tip頭,，移液器,。
儀器：低溫水平離心機(jī), 37°C水浴箱,，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡,，流式細(xì)胞計(jì)
方法：
1 懸浮細(xì)胞的染色：
（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1′106）,，PBS洗2次，1000rpm′10min,。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min,，PBS洗2次，1000rpm′10min,。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min,，PBS洗2次,，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清,，室溫反應(yīng)30min,。
（5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應(yīng)30min
（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次,，1000rpm′10min,。
結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位,。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度,。[圖11]
2：貼壁細(xì)胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長,，待長到
50%~80%滿時(shí),，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。
（2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,，染色步驟同上,。
（3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位,。
結(jié)果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色,、檢測。
4：原代細(xì)胞的培養(yǎng),、檢測,。
5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病
1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時(shí)期,，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平,。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm）,，洗板機(jī)
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）,。
2. 洗滌Buffer洗板三次,，加入封閉液，200 ml/well ,， 37°C孵育2h或4°C
過夜,。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個(gè)重復(fù)孔）100ml/well ,，37°C孵育1h,。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer ,、封閉液為陰性對照,。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well,，37°C孵育1h,。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液,，100 ml/well,，避光反應(yīng)10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應(yīng),，50 ml/well,。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達(dá)水平,。
2． Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平,。
◆ 細(xì)胞凋亡與肝病（一篇綜述）
摘要：細(xì)胞凋亡是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞,。細(xì)胞凋亡偏重于凋亡小體的形態(tài)學(xué)的變化過程,，并且可見于許多非生理狀態(tài)，如疾病所引起的細(xì)胞凋亡和抗癌藥物所引起的癌細(xì)胞死亡等,，而程序性細(xì)胞死亡則偏重于其分子生物學(xué)和生理性功能,，一般指生理性死亡。近年來有關(guān)肝病凋亡的論文發(fā)表量日益增多,，本文就此進(jìn)行綜述,。
一 、細(xì)胞凋亡的特征和檢測方法
細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上有四大特征：1）,、細(xì)胞變圓,，2）、胞漿起泡,，3）,、核固縮，4）,、凋亡小體形成,。形態(tài)學(xué)觀察到凋亡小體是細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn),，但此法并不敏感。（1）瓊脂糖凝膠電泳對凋亡細(xì)胞基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其DNA段呈180-200bp的階梯狀的電泳條帶,。檢測出這種典型的電泳條帶是細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo),。（2）近年來用于檢測細(xì)胞凋亡的技術(shù)還有 TUNEL 法，通常認(rèn)為其對細(xì)胞凋亡數(shù)量的估計(jì)過高,。（3）因此在研究細(xì)胞凋亡時(shí)應(yīng)盡可能的做瓊脂糖凝膠電泳作為對照,。另外還有流式細(xì)胞儀法測凋亡細(xì)胞峰法，通常認(rèn)為它可以測定細(xì)胞凋亡的數(shù)量,，并能夠?qū)乃兰?xì)胞,、活細(xì)胞區(qū)分開來，是一種比較好的檢測方法,?？蛇M(jìn)行定量半定量的分析。（4）
在肝臟凋亡小體被認(rèn)為就是Councilman 小體,、嗜酸性小體和固縮壞死。（5）并且發(fā)現(xiàn)肝臟凋亡發(fā)生迅速,，可在幾分鐘,、幾小時(shí)內(nèi)完成。通常凋亡細(xì)胞的清除是一個(gè)不伴有炎癥的過程,，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物被膜包裹形成凋亡小體而被枯否細(xì)胞,、臨近的肝細(xì)胞清除，細(xì)胞內(nèi)的酶不外溢,。這通常是對的,，然而肝細(xì)胞的凋亡并非人們所想象的那樣隱蔽而不容易被發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞的凋亡過程中可以檢測到細(xì)胞內(nèi)酶,，并且當(dāng)?shù)蛲龅母渭?xì)胞的數(shù)量超過肝組織的清除能力時(shí),，組織結(jié)構(gòu)的丟失將會(huì)發(fā)生炎癥，因此細(xì)胞凋亡在過去認(rèn)為由細(xì)胞壞死觸發(fā)的許多疾病中可能起重要作用,。（6）
二,、細(xì)胞凋亡的機(jī)制
在凋亡的過程中，凋亡啟動(dòng)階段可以與凋亡執(zhí)行階段區(qū)分開來,，在執(zhí)行階段 Caspases( 一組新的特異性水解底物天冬氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶家族),，可以依次激活來水解細(xì)胞和裂解一些關(guān)鍵的蛋白。Caspases通常以酶原Procaspases的形式存在于細(xì)胞胞漿內(nèi),，需要蛋白酶先將其裂解為有功能的蛋白酶的形式才可發(fā)揮作用,。并且現(xiàn)在認(rèn)為Procaspases具有Caspases的活性，但其活性較Caspases為低,。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性,。所以Procaspase-8相互聚集時(shí)可以自我激活或相互激活為Caspase-8,。Procaspases的相互聚集可由結(jié)合調(diào)節(jié)分子介導(dǎo),如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs與Fas 和p75NGF 受體死亡區(qū)域具有相似的結(jié)構(gòu)（6個(gè)折疊閉環(huán),，兩歧性反向平行的α螺旋）,。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”來激活 Caspases。之后Caspases可將蛋白從天冬氨酸鹽羥基端一分為二,。同時(shí)Caspases自身也是通過對其天冬氨酸殘基進(jìn)行裂解而激活,。通常認(rèn)為Caspases是通過其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的過程會(huì)導(dǎo)致Caspases的級聯(lián)放大反應(yīng),。Caspases(-3,，-6，-7)被認(rèn)為是Caspases中下游的Caspases,，并且是分解底物的關(guān)鍵酶,，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。近來已發(fā)現(xiàn)兩條激活Caspases的通路,。一條涉及到死亡因子和死亡受體,，另一條與線粒體功能障礙有關(guān)。(7)
死亡受體是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,，TNF）超家族的成員,。到目前為止共發(fā)現(xiàn)8種死亡受體，其中TNF受體1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又稱CD95/APO-1）白被研究的多,，它們均通過其配體而被激活起作用,。Fas和TNF-α可以動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)不同的死亡復(fù)合體伴隨的調(diào)節(jié)蛋白和procaspases 而活化死亡復(fù)合體，然后由死亡復(fù)合體激活一系列的上游Caspases,，主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶來執(zhí)行促使細(xì)胞凋亡的作用,。(7、8)
在第二條通路,，細(xì)胞應(yīng)激可以促發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體上脫落,，這通常可能是通過線粒體內(nèi)膜的通透性改變而介導(dǎo)的,。脫落的細(xì)胞色素C與 Apaf-1結(jié)合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases執(zhí)行促使細(xì)胞凋亡的作用,。(7)近來的資料表明線粒體和死亡復(fù)合體可以通過Bid蛋白聯(lián)系起來，Caspase-8激活Bid蛋白,，Bid蛋白隨后可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C,。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一員。目前還發(fā)現(xiàn)其它幾種胞漿蛋白參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),，主要是 Bcl-2的家族成員,。目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出至少１５種Bcl-2蛋白。它們可以分成兩大類：促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，如Bax,、Bak,、Bok Bcl-xS、Bag,、Bid,、Hrk、BNIP3,、BimL,、EGL、Blk和Bad,；抑制細(xì)胞凋亡的,，如Bcl-2、Bcl-xL,、Bcl-w,、Mcl-1、Bfl-1,、Brg-1,、和A1。(9,10)促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員能結(jié)伴形成同源或異源二聚體,?？辜?xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員可以與線粒體結(jié)合抑制其釋放細(xì)胞色素C，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用,。(11)已有的研究表明當(dāng)Bcl-2/Bax>Bax/Bax時(shí)，細(xì)胞趨向于存活,，當(dāng)Bcl-2/Bax
１ 酒精性肝病
到目前為止僅有有限的關(guān)于細(xì)胞凋亡在酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD）發(fā)病中作用的報(bào)導(dǎo),。但是細(xì)胞凋亡在ALD發(fā)病中的作用卻日益明朗化。事實(shí)上凋亡在ALD中的表現(xiàn)形式是嗜酸性小體,，而且凋亡的標(biāo)志物和Mallory小體可以在ALD 的肝細(xì)胞中同時(shí)觀察到,，提示這些細(xì)胞在組織中是通過凋亡的形式被清除的。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)性ALD也可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡,，長期給予酒精的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體的數(shù)量明顯增多,，主要集中在肝小葉中央靜脈末端的周圍，這些病變在終止酒精給予后可逆。另一研究表明伴有肝損傷（如脂肪肝或肝炎癥侵潤）的酒精飼養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,。潛在的肝病理狀態(tài),，使肝細(xì)胞更易于發(fā)生酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，這在肝鐵超負(fù)荷時(shí)可以見到,，而肝鐵超負(fù)荷可見于許多酒精性肝病患者,。在一個(gè)研究肝鐵影響的大鼠模型中，在這些動(dòng)物中凋亡細(xì)胞的數(shù)量超過了肝鐵儲(chǔ)積的作用,，提示尚有其它的途徑參與肝細(xì)胞凋亡,。
酒精導(dǎo)致得肝損傷被認(rèn)為與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的活性氧中間產(chǎn)物有關(guān)。在急性酒精中毒導(dǎo)致谷胱甘肽缺乏的大鼠模型中可見到許多凋亡的肝細(xì)胞,。伴隨著氧化應(yīng)激在酒精導(dǎo)致得肝損傷中的作用,，抗氧化劑在同一動(dòng)物模型中可以減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量?；钚匝踔虚g產(chǎn)物和脂質(zhì)過氧化的形成被認(rèn)為與細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)有關(guān),，而CYP2E1在肝細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。在導(dǎo)入CYP2E1表達(dá)的肝細(xì)胞中,，由活性氧中間產(chǎn)物介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和隨后在那些富含花生四烯酸的肝細(xì)胞中可見到細(xì)胞凋亡,。同樣通過導(dǎo)入Bcl-2可以阻止由CYP2E1介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。另一研究在有明顯炎癥和脂質(zhì)過氧化的實(shí)驗(yàn)性ALD模型中發(fā)現(xiàn)Bcl-2 蛋白表達(dá)增加,。因此肝細(xì)胞通過表達(dá)抗凋亡的Bcl-2蛋白可能是其抵抗酒精誘導(dǎo)的肝損傷的一種保護(hù)機(jī)制,。
氧化應(yīng)激也被認(rèn)為與Fas系統(tǒng)相關(guān)，在酒精性肝損傷的病人中,，肝細(xì)胞Fas配體mRNA轉(zhuǎn)錄增多,，體內(nèi)Fas配體可能是由活性氧中間產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的。由于肝細(xì)胞可表達(dá)Fas受體,，這些發(fā)現(xiàn)提示肝細(xì)胞可能通過旁分泌或自分泌的機(jī)制來介導(dǎo)自身的死亡,。這種由酒精誘導(dǎo)肝損傷的潛在尚未*闡明的重要機(jī)制被稱為“fractricide”.
其它的幾種細(xì)胞因子也可以參與酒精導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。纖維原性生長因子,，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)可誘導(dǎo)培養(yǎng)的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,，在ALD的進(jìn)展中可能具有雙重作用：1）促進(jìn)纖維化，2）通過凋亡殺死細(xì)胞,。另外TNF-α1活性在臨床ALD病人中和實(shí)驗(yàn)性ALD大鼠的肝細(xì)胞中表達(dá)均增強(qiáng),。慢性酒精消耗也可使肝細(xì)胞TNF-α1表達(dá)增加?？傊?，在慢性酒精消耗TNF-α1表達(dá)上調(diào)使肝細(xì)胞易于發(fā)生由這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示TNF-α1在ALD發(fā)病的病理生理中其重要作用,。( 以上參考文獻(xiàn)2,，6，12，13,，14,，15，16,，17)
2 病毒性肝炎
研究表明肝細(xì)胞凋亡在病毒性肝炎中起重要作用,。病理形態(tài)學(xué)研究表明人肝炎中的確存在死亡的凋亡細(xì)胞，事實(shí)上在病毒性肝炎中可以經(jīng)常觀察到肝細(xì)胞以凋亡的行式被清除掉,，病毒感染伴隨凋亡被認(rèn)為是由細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic Tlymphocyte,，CTL）作用的結(jié)果。CTL在識(shí)別病毒抗原是誘導(dǎo)自身表達(dá)Fas配體,，并與靶細(xì)胞表面的Fas結(jié)合,，啟動(dòng)凋亡信號，活化細(xì)胞死亡程序,，使細(xì)胞死亡,。已有的資料提示有幾種不同的凋亡通路參與了肝細(xì)胞的凋亡，包括Fas系統(tǒng),、TNF-α系統(tǒng),、Perforin/Granzyme系統(tǒng)。
對于細(xì)胞凋亡在病毒性肝炎中的作用僅有有限的資料,。小樣本的資料研究表明在三例爆發(fā)性乙型病毒性肝炎中Fas蛋白表達(dá)增多,。TUNEL分析表明大多數(shù)肝細(xì)胞呈陽性，提示Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡參與急性肝炎的發(fā)病,。
HBV和HCV是慢性肝病的主要致病因素,。這些病毒感染使肝細(xì)胞易于發(fā)生凋亡，也可以通過model和病毒蛋白抑制凋亡,。例如在小鼠肝細(xì)胞系中,，TNF-α只能誘導(dǎo)高度表達(dá)HBV的肝細(xì)胞發(fā)生廣泛的凋亡。感染HBV的肝細(xì)胞對促進(jìn)凋亡因素的敏感性增高被認(rèn)為與HBV的X-基因產(chǎn)物有關(guān),；同樣HCV感染的肝細(xì)胞，HCV的病毒核心蛋白可以與TNF-αR1的胞漿內(nèi)區(qū)域結(jié)合,，這種相互作用在小鼠和人肝細(xì)胞株均可通過TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡,。HBV、HCV感染肝細(xì)胞凋亡的敏感性增高的機(jī)制是不十分清楚的,，但可能與TNF-αR1表達(dá)上調(diào)無關(guān),。為了完成自身的復(fù)制和阻止感染的肝細(xì)胞被清除，病毒同時(shí)發(fā)展了阻止凋亡的機(jī)制,，這可以從HCV的NS3蛋白可抑制放線菌素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中得到例證,。病毒蛋白對凋亡的總體作用似乎與凋望刺激物、細(xì)胞內(nèi)容物和不同的病毒蛋白表達(dá)的相對水平有關(guān)。
目前的臨床研究資料提示在HBV和HCV感染的肝細(xì)胞中有免疫介導(dǎo)的凋亡途徑激活,。在慢性HCV感染的40位病人的肝組織中用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)其Fas 和HCV核心蛋白抗原的表達(dá)明顯高于健康者,。在慢性HBV感染的病人也可以觀察到其Fas系統(tǒng)激活，并且Fas不但在肝細(xì)胞中高度表達(dá),，而且在分子水平上上調(diào),。有趣的是Fas mRNA主要在淋巴細(xì)胞浸潤的區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，這也支持CTL介導(dǎo)感染肝細(xì)胞通過Fas系統(tǒng)發(fā)生凋亡,。因此人們推測以凋亡的形式清除肝細(xì)胞可能是：1）感染了肝炎病毒的肝細(xì)胞表面除了病毒抗原和MHCⅠ類抗原外,，F(xiàn)as表達(dá)也增多。2）肝炎病毒抗原和MHCⅠ類抗原與CTL表面的T細(xì)胞受體結(jié)合,，活化CTL誘導(dǎo)其表達(dá)Fas配體,。3）表達(dá)于CTL表面的Fas配體與肝細(xì)胞表面的Fas結(jié)合，傳導(dǎo)死亡信號,，激活caspases 等使肝細(xì)胞死亡,。（以上參考文獻(xiàn)2，6,，12,，14，17,，18,，19，20）
3 膽汁淤滯性肝病
在許多臨床綜合征中可以觀察到膽汁淤滯,，膽汁淤滯是一組慢性進(jìn)行肝病的主要特征,，并可終導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和死亡,。肝內(nèi)疏水的毒性膽鹽儲(chǔ)滯長期以來被認(rèn)為是肝損傷的一個(gè)主要原因,，并被認(rèn)為是膽汁淤滯性肝病肝損傷的一個(gè)關(guān)鍵原因。事實(shí)上肝內(nèi)毒性膽鹽：鵝脫氧膽酸和脫氧膽酸鹽的儲(chǔ)滯水平與肝損傷的程度呈正相關(guān),。在大多數(shù)膽汁淤滯性肝病中廣泛的壞死并不常見,，因此細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡在膽汁淤滯性肝病中遠(yuǎn)較細(xì)胞壞死為常見。如在原發(fā)性膽管性肝硬化的病人肝組織中凋亡的特征較對照組為明顯,。毒性膽鹽誘發(fā)的凋亡近年來已被部分闡明,。毒性膽鹽可誘導(dǎo)培養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是由非Fas配體依賴性途徑激活裂解激活Caspases-8,，然后由其激活下游的Caspases導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡,。組織蛋白酶B（一種胱氨酸蛋白酶）在這種凋亡中起重要的作用，實(shí)際上胱氨酸蛋白酶被激活后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)作為毒性膽鹽導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物而起作用,。毒性膽鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡同時(shí)需要蛋白激酶C的激活和轉(zhuǎn)位,，使細(xì)胞內(nèi)的鎂離子增多,，激活鎂依賴性核酸內(nèi)切酶降解 DNA。然而非毒性的疏水膽鹽：熊去氧膽酸和一種毒性膽鹽同時(shí)加入培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi),，死亡的肝細(xì)胞減少,。所以認(rèn)為熊去氧膽酸有抗凋亡的作用，這可能與其降低線粒體的通透性有關(guān),。因此抗凋亡作用可能是熊去氧膽酸在膽汁淤滯性肝病中發(fā)揮治療作用的重要機(jī)制,。
對于Bcl-2在抗毒性膽鹽誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的作用，已有人用膽道結(jié)扎的方法作為膽汁淤積的模型進(jìn)行研究,，正常情況下肝細(xì)胞并不表達(dá)Bcl-2,。然而在膽道結(jié)扎的小鼠中，可發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá),，提示這是肝細(xì)胞的一種適應(yīng)性機(jī)制來抵抗毒性膽鹽導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,。在于膽汁分泌直接相關(guān)的膽管細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步支持這一看法,。在原發(fā)性膽管性肝硬化病人的肝組織中也可發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá),。具有抗凋亡作用的Bcl-2表達(dá)被認(rèn)為可以阻止毒性膽鹽介導(dǎo)的肝損傷。（以上參考文獻(xiàn)2,，6,，12，14,，18,，19）
4 肝細(xì)胞腫瘤
上述所提到的肝病有一個(gè)共同的特點(diǎn)，既細(xì)胞凋亡的數(shù)量與正常對照組相比均提高,，從而導(dǎo)致肝損傷,。而在肝細(xì)胞腫瘤（hepatocelleular carcinoma，HCC）形成中損傷DNA和惡性細(xì)胞凋亡不足被認(rèn)為是一個(gè)決定性因素,。研究表明在HCC多步形成機(jī)制中凋亡不足起重要的作用,。有人分析22例HCC病人肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Fas表達(dá)部分或全部缺失，而在健康的肝組織中可表達(dá),。另一研究表明Fas與HCC的分化程度有關(guān)：在低分化,、門脈腫瘤栓塞、肝外浸潤的HCC中,，F(xiàn)as表達(dá)明顯降低,，這些結(jié)果均支持Fas表達(dá)缺失是惡性腫瘤細(xì)胞逃避CTL細(xì)胞殺傷和促進(jìn)其生存的一條重要途徑。另一研究在給于不同的化療藥物治療后均有P-53依賴性Fas表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的肝腫瘤細(xì)胞的凋亡增加,并且呈劑量依賴性,。
TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡異常被認(rèn)為是HCC 形成的又一重要的細(xì)胞因子。如前所述TGF-β1能夠誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,。TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及兩種不同的受體：1型和2型,。TGF-β1選擇性的與2型受體結(jié)合,，之后與1型受體形成復(fù)合物，激活下游的的信號傳導(dǎo),。在HCC病人1型,、2型受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常,。另一項(xiàng)研究提示盡管在HCC病人的肝細(xì)胞中有2型受體的表達(dá),，但彌散分布在胞漿內(nèi)，在細(xì)胞膜上不能檢測到,。這些研究均提示肝細(xì)胞膜上TGF-β2型受體的表達(dá)缺陷是腫瘤細(xì)胞逃避TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而增殖的原因,。
HCC的肝細(xì)胞凋亡數(shù)與P53蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)，支持P53在腫瘤性肝損傷中參與腫瘤細(xì)胞凋亡,。P53蛋白是一種腫瘤抑制基因,，而其表達(dá)的P53蛋白是細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)所不可少的。如果DNA不能修復(fù),，P53便誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,。因此P53的功能不良使腫瘤細(xì)胞可逃避凋亡而不斷增殖。（以上參考文獻(xiàn)2,，6,，12，14,，17,，20，22,，23,，24。）
總之由以上分析可見,，細(xì)胞凋亡在肝病發(fā)病的病理生理中起重要作用,。細(xì)胞凋亡的增多涉及許多不同的介導(dǎo)因子，如Fas,、TNF- α,、TNF-β1和Bcl-2家族在許多不同的肝損傷中均可發(fā)揮作用，這些疾病包括病毒性肝炎,、膽汁淤滯性肝病和酒精性肝病,。在這些疾病中凋亡的減少可能是有益的，并是未來藥物發(fā)展的方向,。 在另一方面,，凋亡的調(diào)節(jié)異常使惡性的肝腫瘤細(xì)胞可避免被殺傷。對于HCC的預(yù)防和治療來說特異地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)新的有價(jià)值的選擇,。
參考文獻(xiàn)
1 Palejuala A, Alastair JM. Apoptosis and gastrointestinal disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr.2000 August; Vol 34(4):356-361.
2 Galle Peter R, Gores Gregory J. Apoptosis in liver disease. J Hepatol.Vol 27(2): 405-412.
3 Patel T, Robbers LR, Jones BA, et al. Dysregulation of apoptosis as a mechanism of liver disease : an overview. Semin Liver dis.1998; 18: 105-114.
4 金惠銘,，殷蓮花,。 主編 臨床病理生理學(xué)(版). 上海醫(yī)科大學(xué)出版社 1999;11:p35-39.
5 Alison MR, Saraf CE. Liver cell death: patterns and mechanisms. Gut 1994;35:577-581.
6 Feldmann G, Saraf CE. Liver apoptosis. J Hepatol. 1997;Vol 26(suppl 2):1-11.
7 Green D. Apoptotic pathway: the roads to Ruin.Cell.1998.Vol94:695-698.
8 LuoX, Budihardjo I, Iou H, et al. Bid, a Bcl-2 interacting protein ,mediates cytochrome C release from mitochondria in response to activation of surface death receptors. Cell.1998;94:481-490.
9 Adams J, Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. science. 1998;281:1322-1326.
10 Read JC. Double identity of protein of the Bcl-2 family. Nature. Vol 387(19): 773-776.
11 Kluck R, Bossy We, Newmeryer D. The release of cytochrome C from mitochondria: a primary site of Bcl-2 regulation of apoptosis. Science.1997;275: 1132-1136.
12 吳雪平。Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡與肝臟疾病,。國外醫(yī)學(xué)•免疫學(xué)分冊,。1999；Vol 22(2): 68-71
13 Lumeng L, Crabb D. Alcoholic liver disease. Current opinion in Gastroenterology.2000 May; Vol 16(3):208-218.
14 Rust C, Gores G. Apoptosis and liver disease. Am J Med.2000 May; Vol 108(2): 567-574.
15 Simpson KJ, Lukacs NW, Colletti l, et al. Cytokines and the liver disease. J Hepatol.1997 December; Vol 27 : 1120-1132.
16 Mclain C, Hill D, Schmidt j, et al. Cytokines and alcoholic liver desease.Hepatoloy.1995; 21: 1725-1741.
17 Behedetti Antonio, Marucci L. The significance of apoptosis in the liver. Liver.1999; Vol 19 : 453-463.
18 Nanji. Apoptosis and alcoholic liver desease. Semin Liver Dis.1998; 18:105-114.
19 Faubion W, Gores G. Death receptor in the biology and pathology. Hapatology 1999,Vol29:1-4.
20 Lau J Y N. Apoptosis and viral hepatitis. Sem Liver Des.1998; 18:168-176.
21 Zhao M, Zimmermann A. Apoptosis in human hepacellular carcinoma and in liver cell dysplasia in correlated with P53 in immunoreactivity. J Clin Pathol.1997; 50:394-400.
22 Hollstein M, Sidransky D, Volgelstein, et al. P53 mutation in human cancer.science.1991;253:49-53.
23 Massague J, Weis-Garcia F, Serine/threonine kinase receptors:mediators of transforming growth factor-beta family singals. Cancer Surv.1996;27:41-64.
24 Bedossa P, Chari RS, Kong Fm, et al. Transforming growth factor-beta 1 TGF-beta 1 and TGF-beta 1 receptors in normal,cirrotic,and neoplastic livers.Hepatology.1995;21:760-766.