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細(xì)胞裂解液的制備
閱讀：546 發(fā)布時(shí)間：2018-8-7一,、試劑準(zhǔn)備
1,、新鮮配制冷的 RIPA 裂解緩沖液:
150 mM NaCL
1% NP-40 (去垢劑)
0.1% SDS (去垢劑)
2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
1 mM PMSF (蛋白酶抑制劑)
1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制劑)
1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑)(任選)
以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。
2,、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF
1.5 mM EDTA
1mM NaVanadate （釩酸鈉）(任選)
3,、對數(shù)期生長狀態(tài)佳的細(xì)胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長面積）,。
二,、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上,， 用吸液管吸出培養(yǎng)液,。加入足夠的冷的 PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基,，倒掉PBS ,，重復(fù)以上操作2-3遍。在后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS,，盡量在冰上操作,。
2、 向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液 (每75cm2 培養(yǎng)瓶加1ml). 然后用細(xì)胞刮子沿著瓶壁開始刮細(xì)胞,，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶,，則將瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮 (由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點(diǎn)的吸液管吸取),。
3,、 吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于14ml 離心管中 （置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細(xì)胞,。
4,、 盡可能將多的細(xì)胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進(jìn)行超聲,，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn),，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀,，應(yīng)離心10000rpm,10分鐘,，留取上清。
5,、 取出小量細(xì)胞裂解液測其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計(jì),，在A280測定），分裝保存在 -70℃,。