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蛋白樣品的定量
閱讀：402 發(fā)布時(shí)間：2018-8-7目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）,、Lowry法（Folin-酚試劑法）,、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn),，大家可以根據(jù)具體情況選取,。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測(cè)定樣品濃度,。
收集完蛋白樣品后,，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法,。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據(jù)具體情況選取,。
Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）:
考馬斯亮藍(lán)G-250有紅,、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下,，可配成淡紅色的溶液,，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595 nm處有大吸收值,，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比,。
該法操作簡(jiǎn)便迅速，消耗樣品量少,，但不同蛋白質(zhì)之間差異大,，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。高濃度的Tris,、EDTA,、尿素、甘油,、蔗糖,、丙酮、硫酸銨和去污劑對(duì)測(cè)定有干擾,。緩沖液濃度過高時(shí),，改變測(cè)定液pH值會(huì)影響顯色。
Lowry法（Folin-酚試劑法）:
福林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理是：首先在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物,，該復(fù)合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍(lán)色復(fù)合物,。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量成正比,，蛋白質(zhì)濃度范圍約在25～250 μg/mL,。
雖然該法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用廣泛的方法之一，但其缺點(diǎn)也很明顯,，專一性較差,，干擾物質(zhì)多（如Tris緩沖劑、蔗糖,、硫酸銨,、巰基化物、酚類,、檸檬酸等）,，標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線關(guān)系不特別嚴(yán)格,。因此在其應(yīng)用過程中有很多新的修正。
BCA法（二喹啉甲酸法）:
二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,，BCA )法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法,，是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似,，即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物,，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物,，在堿性條件下,，可以和Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值,，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
與Lowery法相比,，BCA蛋白測(cè)定方法操作更簡(jiǎn)單,，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好,，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響,，靈敏度高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5 μg/ml），應(yīng)用更加靈活,。與Bradford法相比,，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。
BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。Bradford 法敏感度高,，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容,。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的，其主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性,。