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1,、pcDNA3.1＋-gD的線性化: pcDNA3.1＋使用說明書推薦了以下幾個酶作為線性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通過DNAMAN分析gD序列發(fā)現(xiàn)其帶有MfeⅡ酶切位點,。

2、轉染前一天,在60mm的dish中接種8×105個細胞,加入5ml培養(yǎng)基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培養(yǎng),至轉染時要求細胞40%-80%匯合,。

3,、通過分光光度計測定pcDNA3.1＋-gD的濃度,用不含血清,、抗生素、蛋白質的培養(yǎng)基稀釋2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至總體積150ul,，其小濃度不低于0.1ug/ul,稀釋后應顛倒幾次EP管以混勻混合物,。

4、向混勻的混合物中加入15ul轉染試劑(PolyFect Transfection Reagent  QIAGEN),用加樣器吹打5次,。

6,、在室溫下(20-25℃)孵育混合物5-10分鐘。

7,、在孵育的同時,，吸出dish中的培養(yǎng)基，用PBS液洗滌一次,，加入3ml的培養(yǎng)基(含血清,，不含抗生素)。

8,、孵育完成后加入1ml培養(yǎng)基(含血清),用加樣器吹打2次,，將產(chǎn)物全部加入60mm的dish中，輕輕搖動dish以混勻,。

9,、37℃,5%CO2培養(yǎng)，在細胞匯合度不超過50%時加入G418進行篩選,。

轉染時轉染兩組細胞,，組一在轉染后細胞匯合度不超過50%時（一般是24小時）加入G418進行篩選；組二在轉染后待細胞匯合度達到80%時1/4000,、1/1000,、1/300分別接種于dish中，48小時后加G418篩選,。

10,、加入G418后，每3天更換一次含有篩選濃度的G418,。當有大量細胞死亡（5-7天）時,，可以把G418的濃度減半維持篩選（此時可以加入適應性培養(yǎng)基1：4來改善細胞對培養(yǎng)基的同化作用）。

11,、篩選10-14天后,，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng),，待其逐漸增大后,，制備細胞懸液，記數(shù),，用培養(yǎng)基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔,。待其逐漸增大后轉入48孔板中增殖（為了減少實驗失誤帶來的風險建議凍存部分增殖細胞）,。

12、細胞大量擴增后,，提取總DNA,，做PCR檢測目的基因是否存在。