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流式細胞儀檢測細胞凋亡方法（Annexin V 法）
閱讀：1728 發(fā)布時間：2018-7-19實驗原理
Annexin V是檢測細胞凋亡的靈敏指標之一,。它是一種磷脂結(jié)合蛋白,，可以與早期凋亡細胞的胞膜結(jié)合,，而細胞質(zhì)膜的改變是細胞發(fā)生凋亡時早的改變之一。在細胞發(fā)生凋亡時,，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè),。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，因而與細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合,。由于在發(fā)生凋亡時,，磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細胞核的改變，因此,，與DNA碎片檢測比較,，使用Annexin V可以更早地檢測到凋亡細胞。因為細胞壞死時也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻,，所以Annexin V常與鑒定細胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用,，來區(qū)分凋亡細胞(Annexin V /核酸染料-)與死亡細胞(Annexin V /核酸染料 )。
實驗試劑
1. PBS緩沖液：含0.1%NaN3,，過濾后2-8°C保存,。
2. Annexin V Binding Buffer緩沖液(Cat. No. 6621E)：濃度為10×,，使用時，用稀釋為1×濃度的應(yīng)用液,。
3. Annexin V試劑與核酸染料：
Annexin V 核酸染料
Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 662E)或
Streptavidin-FITC(Cat. No. 3024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E)
Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
實驗設(shè)備
1. 一次性12×75mm Falcon試管,。
2. 微量加樣器和加樣頭。
3. FACS流式細胞儀：上樣檢測,。
4. CELLQuest軟件：獲取和分析試驗數(shù)據(jù),。
5. Annexin V檢測對照管：
Annexin V A-陰性對照 B-補償1 C-補償2
Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin和SAv-FITC PI和SAv-FITC
PE 未染色細胞 Annexin V-PE 7-AAD
FITC 未染色細胞 Annexin V-FITC PI
實驗步驟
1. 取Falcon試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號,。
2. 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次,，再用1× Binding Buffer緩沖液制成1×106細胞/ml的懸液。
3. Falcon試管中加入100 μl細胞懸液,。
4. 按以下體積加入Annexin V與核酸染料：
管號 名稱 熒光標記Annexin V 核酸染料
1 陰性對照 - -
2 單陽1 AV-FITC -
3 單陽2 - PI
4 樣本 AV-FITC PI
5. 輕輕混勻,，室溫(20°C ~25°C)避光處放置15分鐘。
6. *使用Annexin V-Biotin試劑進行檢測時：
1×Binding Buffer緩沖液洗細胞一次,，去上清。
1×Binding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg,，加入到細胞管中,。
輕輕混勻。
加入5μl PI,，室溫(20-25°C)避光處放置15分鐘,。
7. 各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μl。
8. 1小時內(nèi)上流式細胞儀測定結(jié)果,。