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實(shí)驗(yàn)試劑

高保真聚合酶(pfu ultra)，限制性內(nèi)切酶(XhoI,、SpeI,、BamHI、SpeI,、SacI),，金粉，無(wú)水乙醇,，2.5MCaCl2,，20ul 0.1M亞精胺
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀，PDS-1000/He型基因槍,，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 510 )
實(shí)驗(yàn)材料

洋蔥
實(shí)驗(yàn)步驟

1. 載體的構(gòu)建
pA7- CFP- AtCOP1,，pA7-AtCRY1-YFP
pA7- CFP-OsCOPl，pA7-OsCRY1b-YFP
中間載體pA7-CFP和pA7-YFP為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,。將AtCOPl(引物為AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物為AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分別用高保真聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，純化PCR產(chǎn)物,，用XhoI/SpeI雙酶切后，分別連接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位點(diǎn)上,，得到pA7-AtCOP 1-CFP,，pA7-AtCRYl-YFP。
將OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3'),，純化PCR產(chǎn)物,，用BamHI/SpeI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點(diǎn)中，得到pA7-OsCRYlb-YFP,。
將嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3'),，純化PCR產(chǎn)物，用XhoI/SacI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點(diǎn)SalI/SacI中,，得到pA7-OsCOPl-CFP,。所有克隆經(jīng)DNA測(cè)序正確后使用。
2. 基因槍操作
   1) 微彈制備(金粉母液制備)
      a. 稱取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管,。
      b. 加入1mL(或50uL)無(wú)水乙醇,，振蕩lmin，10,000rpm離心l0s,。
      c. 棄上清,，加入1mL(或50uL)無(wú)菌水，振蕩lmin,，10,000rpm離心l0s,。
      d. 棄上清，加入1mL(或50uL)無(wú)菌水,，振蕩1 min,，-20℃保存。
   2) DNA的包裹
      a. 取50uL金粉懸液于Eppendorf管,。
      b. 依次加入5uL質(zhì)粒DNA (1ug/ul),，50ul 2.5MCaCl2和20ul 0.1M亞精胺(每加完一樣，振蕩2-3秒),。
      c. 振蕩3min,，10,000rpm離心10-20秒，棄上清,。
      d. 加250ul無(wú)水乙醇,，振蕩重懸，10,000rpm離心10-20秒,，棄上清,。
      e. 用60ul無(wú)水乙醇定容(需重懸)。
   3) 基因槍操作
      a. 基因槍轟擊的前一天將新鮮洋蔥的鱗葉切成小塊(3-5cm長(zhǎng)寬)，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜,。
      b. 轟擊之前將洋蔥的內(nèi)表面朝上,，用PDS-1000/He型基因槍將上述質(zhì)粒轟擊入洋蔥內(nèi)表皮，黑暗培養(yǎng)24h,。
      c. 激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)(Carl Zeiss LSM 510 ),。