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實驗試劑

細胞培養(yǎng)液成分為RPMI1640基本培養(yǎng)液 10%胎牛血清 1%三抗,，PBS，凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油),，Trypsine-EDTA消化液，液氮
實驗設(shè)備

水浴鍋,，35mm培養(yǎng)皿,，37℃培養(yǎng)箱,，無菌凍存管,，低溫冰箱，超低溫冰箱
實驗材料

已凍存的HEK293和HeLa細胞

實驗步驟

1. 細胞的復(fù)蘇
    1) 保存細胞的冷凍管直接投入37℃溫水,，不時搖動令其盡快融化,，解凍1分鐘；
    2) 取出冷凍管,，用酒精消毒后打開管蓋,，吸出細胞懸液,，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,，混合后低速離心，除去上清液,，再用培養(yǎng)液重復(fù)洗一次,；
    3) 用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種35mm培養(yǎng)皿中,，反復(fù)吹打混勻后,，放在37℃的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),，次日更換培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng)。
2. 細胞的傳代(貼壁細胞的消化法)
    1) 吸出皿內(nèi)舊的培養(yǎng)基,，加PBS于皿中，清洗兩次,，用于洗去瓶內(nèi)殘存的血清,，以防止血清對胰蛋白酶活性的影響,；
    2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液輕輕搖動,，使消化液流遍所有細胞表面充分消化細胞，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,、細胞間隙增大后,，立刻終止消化,；
    3) 吸出消化液,，再加培養(yǎng)液，反復(fù)吹打至沒有細胞團,。吹打動作要輕柔,，盡可能不要出現(xiàn)泡沫,，這些都會對細胞有損傷。將細胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿中,。
3. 細胞的凍存
    1) 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，是對數(shù)生長期細胞,，已經(jīng)長滿的細胞凍存后生存率低,。凍存前一天換一次培養(yǎng)液；
    2) 用Trypsin-EDTA把單層生長的細胞消化下來,，懸浮生長的細胞則不需處理,。依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管并計數(shù)離心,；
    3) 去除Trypsin-EDTA,，加入配制好的凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油)，凍存液中細胞的終密度為106/ml-107/ml,。用吸管輕輕吹打使細胞均勻,，然后分裝入無菌凍存管,，每個凍存管加液1-1.5ml,。凍存管上標明細胞的名稱；
    4) 把凍存管放入4℃冰箱30min,；然后轉(zhuǎn)移至-20℃2h,；隨后將凍存管轉(zhuǎn)移到-80℃過夜；第二天迅速浸入液氮中長期保存,。要適當掌握降溫速度,，過快會影響細胞內(nèi)水分的滲出,，太慢則促進冰晶的形成。