日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

膜蛋白具有多種功能，在細(xì)胞識(shí)別,、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、運(yùn)輸?shù)扔兄兄匾慕巧虼艘彩堑乃幬锇悬c(diǎn),。抽提膜蛋白主要是進(jìn)行蛋白組分析：常用的實(shí)驗(yàn)是非變性膠電泳,、酶活分析、SDS-PAGE,、western blot 等,。本文敘述了總蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法,。 

一,、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡(jiǎn)易法) 

1.  自配裂解液(pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA , 100 mM NaCl,，0.5% Triton X-100,，調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1 μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF,。該裂解液用量為10-50 ml 裂解液/1 g濕菌體,。 

2.  將40 ml 菌液在12000 g，4 ℃下離心15分鐘收集菌體,，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,，沉淀加入1 ml裂解液懸浮菌體。 

3.  超聲粉碎,，采用300 w，10 s超聲/10 s間隔,，超聲20 min,，反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。
4.  1000 g離心去掉大碎片,，上清可直接變性后PAGE電泳檢測(cè),，或者用1% SDS溶液透析后凍存。

缺點(diǎn)：Western blotting結(jié)果表明,，疏水性跨膜蛋白提取效率有限,。

二、從Trizol裂解液中分離總蛋白

1.  Trizol溶解的樣品研磨破碎后,，加分層,，2-8 ℃下10000 g離心15 min,，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%,。

2.  用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA,。每使用1 ml Trizol加入0.3 ml無水乙醇混勻，室溫放置3 min,，2-8 ℃不超過2000 g離心5 min,。

3.  將上清移至新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì),。每使用1 ml Trizol加入1.5 ml異丙醇,，室溫放置10 min，2-8 ℃下12000 g離心10 min,，棄上清,。

4.  用含有0.3 M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1 ml Trizol加入2 ml洗液,，室溫放置20 min,， 2-8 ℃下7500 g離心5 min，棄上清,，重復(fù)洗滌2次,。后加入2 ml無水乙醇，渦旋后室溫放置20 min,，2-8 ℃下7500 g離心5 min,，棄上清。

5.  冷凍干燥5-10 min,，1%SDS溶液溶解,，反復(fù)吹打，50 ℃溫浴使其*溶解,，2-8 ℃下10000 g離心10 min去除不溶物,。

6.  替代方案：將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8 ℃的1% SDS溶液中透析3次,，1000 g離心10 min去除沉淀,，上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。

三,、從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污劑法)

1.  配制疏水性蛋白提取液(非裂解液)：1% Triton X-114,，150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA,，調(diào)pH值至8.0備用,。

2.  菌液于4 ℃條件下15000 g離心15 min收集菌體;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗滌3次，后于4 ℃條件下15000 g離心15 min收集菌體,。

3.  菌體沉淀加入1 ml冷提取液,，于4 ℃條件下放置2 h,，17000 g離心10 min，去除沉淀取上清,。

4.  將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,，再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37 ℃條件下放置10 min使其分層,。室溫下1000 g離心10 min使液相和去污相充分分層,。

5.  將液相和去污相分開，分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45 min,。

6.  于4 ℃條件下17000 g離心30 min,，用去離子水洗滌沉淀3次。

7.  將沉淀溶解在1% SDS溶液中,，測(cè)定蛋白濃度,，比較液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白較多,，適于進(jìn)一步蛋白實(shí)驗(yàn),。

8.  SDS-PAGE進(jìn)一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。