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抗體標記與檢測指南
閱讀：380 發(fā)布時間：2018-7-11科技文獻中有很多抗體標記方法指南,，我們往往難以選擇方法,。本指南可以幫助您更好的理解標準化學(xué)標記方法及它們的優(yōu)缺點,，同時還介紹了 Lightning-Link一步法抗體標記技術(shù)。該技術(shù)極大簡化了抗體標記步驟,，利用該技術(shù)標記抗體不需要您具備太多化學(xué)方面的知識,，并且手頭操作時間僅需短短的30秒！
抗體與標記物
在多種免疫實驗（流式細胞術(shù), ELISA, western blotting, 免疫組化等）中,，抗體被廣泛應(yīng)用于檢測和定量抗原,。直接識別抗原的抗體被稱為一抗（primary antibody），賦予檢測的特異性,。大多數(shù)免疫檢測中還需加入標記物,，賦予實驗可檢測性。標記物包括有機染料,、熒光蛋白,、有色微粒和酶。
直接檢測法 Vs.間接檢測法
包含標記物的免疫檢測一般有直接法和間接法兩種形式,。直接檢測法中,，標記物通過共價鍵直接連接到一抗上。而對于間接檢測法,，標記物則是共價連接到與一抗特異性結(jié)合的二抗上,。間接法檢測包括兩步：步，用未標記的一抗進行孵育,，抗體與抗原結(jié)合（若存在抗原）,，洗去未結(jié)合的抗體（一般3~5次）,，第二步則是加入標記二抗孵育（通常1小時），洗滌去掉未結(jié)合的二抗,，然后量化結(jié)合在一抗上的標記物,。
在直接法中，標記物直接與一抗共價結(jié)合,，因此僅需與含有抗原的樣本孵育這一步驟,，而且只需一次洗滌，而間接法則需要兩輪孵育與洗滌步驟,。直接法簡化了試驗的流程,，降低了試驗的變異性，增加了數(shù)據(jù)的可靠性,。然而一抗的共價修飾可以導(dǎo)致抗體親和力的改變,，這種情況的出現(xiàn)與標記二抗帶來的非特異性結(jié)合的問題相比而言，顯得無關(guān)緊要,。下表列舉出了直接法與間接法的主要優(yōu)缺點比較,。
表.直接法與間接法的比較
方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
直接法 | 操作簡單，結(jié)果可靠,； 僅需使用一抗,，檢測快速； 無二抗的非特異性結(jié)合,。 | 由于標記可能導(dǎo)致一抗的免疫反應(yīng)性降低,； 信號放大作用較弱。 |
間接法 | 一抗含有多個標記二抗可結(jié)合的表位,，因而靈敏度升高,，信號放大作用較強。 | 二抗可能發(fā)生非特異性結(jié)合,； 孵育及洗滌步驟增多,。 |
既然直接標記法具有很多優(yōu)點，但為何眾多的免疫分析仍采用間接法呢?原因是市場上帶有標記的一抗較少,，而且直接標記一抗較困難,，這在過去也許是您的困擾，但是當(dāng)您讀到本篇指南的后時就會對抗體標記充滿信心,。
抗體標記方法
您僅需理解基本的化學(xué)原理,，哪些基團發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)化學(xué)結(jié)合物的種類去選擇合適的試劑,，而不需要糾結(jié)化學(xué)結(jié)構(gòu)和完整的化學(xué)名稱,。抗體和所有蛋白一樣，是由氨基酸殘基組成的,。蛋白的氨基基團（N-末端及賴氨酸殘基的側(cè)鏈）通常被用于共價鏈接標記物,。盡管在文獻中報道了多種多樣的標記方法和成百上千的化學(xué)修飾試劑，然而實際上只有少數(shù)重要的方法和試劑,。無論何種方法,，幾乎毫無例外的都是將標記物共價連接到抗體分子的賴氨酸殘基上。
以下是幾種主要的抗體標記方法：
1.琥珀酰酯 (NHS)法
當(dāng)使用熒光染料標記時,，通?？少徺I內(nèi)配有NHS琥珀酰酯（也稱為琥珀酰亞胺酯）的活化標記物。在適當(dāng)條件下,，活化的染料可與抗體分子反應(yīng)（抗體分子通常含有多了賴氨酸基團）而形成結(jié)合物,。根據(jù)標記抗體和游離染料的大小不同，過量的活性染料可通過層析法去掉,，純化的步驟會導(dǎo)致一部分標記抗體的損失,，但是為了避免實驗的高背景，這些純化步驟是必要的,。
2.碳二亞胺（Carbodiimides）法
這類試劑（常見的如EDC）在氨基和含羧基的分子間形成共價連接,。碳二亞胺活化羧基，活化的中間體隨后被氨基（抗體分子的賴氨酸殘基）吸附,。碳二亞胺通常用于連接抗體和羧化的顆粒（如乳膠顆粒、磁珠）,，以及其他羧化的表面如微孔板,。碳二亞胺很少用于將蛋白標記物偶聯(lián)到抗體上，因為這兩種分子都含有氨基（賴氨酸）和羧基,。大多數(shù)碳二亞胺試劑都不溶于水,，因此它們主要用于有機合成化學(xué)，比如生產(chǎn)NHS活性染料,。真正用于蛋白/抗體標記的碳二亞胺試劑為EDC（也稱為EDAC）,，常以鹽酸鹽的形式出售。
3.過碘酸鈉（Sodium periodate）法
過碘酸鈉是一種用于活化辣根過氧化物酶的強氧化劑,。這種過碘酸鹽與糖鏈反應(yīng)產(chǎn)生能與抗體的賴氨酸殘基反應(yīng)的醛基,。由于HRP分子本身含有很少的賴氨酸，因而相對容易獲得抗體-HRP結(jié)合物,，且無明顯的HRP多聚化發(fā)生,。該方法的缺點是賴氨酸和醛基結(jié)合物的形成是可逆的，只有在硼氫化鈉還原劑的作用下才能穩(wěn)定,，然而硼氫化鈉有一定的危險性,。
4. 異硫氰酸鹽（Isothiocyanate）法
該方法值得特別一提是因為FITC（異硫氰酸熒光素）的重要意義。FITC作為抗體和蛋白的標記物已使用了很多年。異硫氰酸鹽較NHS琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定,，因此在保存中不易分解,，但是與抗體的反應(yīng)性較差。FITC不溶于水,，須溶于有機溶劑,。該方法的局限性在于反應(yīng)需在PH9.5或更高的條件下進行，否則標記反應(yīng)會非常緩慢,，然而一些單克隆抗體在高PH條件下可能會被破環(huán),。
5.異（基）雙功能試劑 (Heterobifunctional reagents)
當(dāng)標記物為蛋白分子（如堿性磷酸酶AP、藻紅蛋白PE）時,，由于抗體和標記分子都含有大量賴氨酸殘基,，因此標記流程略為復(fù)雜，可能發(fā)生預(yù)期外的其他反應(yīng),。在這種情況下,，通常需要對其中一個分子（如抗體）的一些賴氨酸進行修飾，以此創(chuàng)造一個新的反應(yīng)基團（X）,，而標記物上的賴氨酸作為另一個反應(yīng)基團（Y）,。當(dāng)抗體與標記物混合時，利用雙功能試劑引入Y基團,，隨之與X基團發(fā)生反應(yīng),，從而形成異二聚體結(jié)合物（即標記抗體）。該方法的主要缺點是標記前需要一些分離步驟將X標簽結(jié)合到抗體上,，這些分離步驟對標記反應(yīng)是不利的,。
緩沖液及添加物--抗體標記的關(guān)鍵因素
抗體溶液中除抗體蛋白分子外，可能還含有少量其他物質(zhì)如緩沖液,、鹽,、或其他蛋白及添加物。添加物對不同標記方法的影響程度不同,，但絕大多數(shù)的標記抗法都是利用抗體分子上的賴氨酸殘基,，因此在標記反應(yīng)中應(yīng)避免加入含有伯胺的緩沖液或添加物。有時,，標記反應(yīng)前需要重新純化抗體,，尤其當(dāng)抗體中含有穩(wěn)定蛋白（BSA）或低分子量物質(zhì)（氮化鈉、Tris,、甘氨酸）時,。甘氨酸和Tris緩沖液常用來純化和中和抗體，后加入氮化物來防止微生物的滋生,。純化實驗中常用低PH值的檸檬酸洗脫抗原親和柱上的抗體,，然而檸檬酸會對碳化二亞胺參與的反應(yīng)產(chǎn)生嚴重的干擾。因此，純化過的抗體在標記前需要進行透析,。需要特別注意的是,，透析時如能更換2-3次緩沖液，那么去除小分子雜質(zhì)的效率更高,。這并不意味著您需要準備3倍或更大量的緩沖液一次性來透析,，恰恰相反，多次透析延長了透析的時間,，從而達到更好的雜質(zhì)去除效果,。如用1L的緩沖液透析3次的效果遠比用5L的緩沖液透析一次的效果好。如果透析后需要加入氮化合物,，盡可能使用低的濃度（如0.02%）或者將抗體以濃縮形式保存,。例如，在5mg/ml 抗體中加入0.02%氮化物,，若后續(xù)標記實驗使用1mg/ml 抗體時,，氮化物的濃度則降低為0.004%；然而如果將0.1% 氮化物加入0.5 mg/ml抗體溶液中,，毫無疑問會對標記反應(yīng)產(chǎn)生嚴重的干擾,。
抗體濃度及純度
大多數(shù)標記反應(yīng)對抗體都有一個純度要求（如>90%，>95%）和濃度要求（至少0.5mg/ml）,。市售的許多商業(yè)化抗體一般都是適用于標記的純化形式,，但并非所有情況都如此，有些抗體常以雜交瘤組織培養(yǎng)上清（TCS）,、腹水或血清等形式出售,。TCS通常含有多種其他蛋白和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸），這對于標記是個非常大的問題,。如果您使用的是TCS，那么純化（如過蛋白A柱）步驟則是必需的,。腹水和血清原液中的抗體濃度較TCS中的抗體濃度高,，但它們同樣也是不純的，含有高濃度的干擾物質(zhì),，進一步的純化往往也是必要的,。
上述介紹了常用的傳統(tǒng)標記方法以及每種方法的優(yōu)勢和劣勢。下面要介紹一種新式的標記方法（Lightning-Link®）,，該方法相比傳統(tǒng)方法有很多優(yōu)勢