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酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位,；（2）研究抗酶抗體的合成；（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng),；（4）定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份,。

實(shí)驗(yàn)原理

雙抗體夾心法（常用于測(cè)定抗原）

用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品,，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在,，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后,，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體,，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量,。

實(shí)驗(yàn)步驟

一,、材料準(zhǔn)備

1. 實(shí)驗(yàn)材料：血清、血漿,、體液

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)比色計(jì),、96 孔板、移液槍,、離心管,、離心管盒

3. 所需試劑及試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液、抗體球蛋白,、吐溫-20,、檸檬酸、硫酸

二,、實(shí)驗(yàn)操作

1. 包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度（1～10 μg /ml）,，每凹孔加 0.3 ml，4℃ 過(guò)夜,，或 37℃ 水浴 3 小時(shí),，貯存冰箱。

2. 洗滌：移去包被液,，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次,，每次 5 分鐘。

3. 每凹孔加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本,，37℃ 作用 1～2 小時(shí),。

4. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次,，每次 5 分鐘,。

5. 加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃ 作用 1～2 小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間,。

6. 洗滌：移去包被液,，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘,。

7. 加入 0.2 ml 底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD 或 OT）,，室溫作用 30 分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 終止劑）,。

8. 加終止劑：每凹孔加 2M H₂SO₄ 或 2 M 檸檬酸 0.05 ml,。

9. 觀(guān)察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD 用 492 nm）OD 值。

ELISA 的影響因素

1. 固相載體

可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式,，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件,。許多物質(zhì)可作為固相載體,，但在 ELISA 中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。

每批制品在使用前,，須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定,，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣，用 0.2 ug / ml 純化的正常人 IgG 進(jìn)行包被,，經(jīng)洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng),，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后,，逐孔在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其消光值,、光密度（OD 值）。

一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组g OD 值的誤差不超過(guò) 10% 為合格,。如果中間孔與四周孔 OD 值相差太大,，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的 OD 值相差大，均不合格,。此外,，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清 OD 值是否有明顯差別。一般要求有 10 倍左右的差異為合格,。

2. 抗原

在 ELISA 中,，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來(lái)源和制備方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的,，且要求是和穩(wěn)定的制劑,，純度和免疫原性要高。而且抗原包被固相載體除濃度外,，對(duì)時(shí)間,、溫度、PH 均有關(guān)系,。

溫度高（如 37℃,、45℃、或 56℃）,，包被時(shí)間可縮短,，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見(jiàn),，通常采用 4℃ 包被過(guò)夜,，可使抗原吸附得更加*且均勻,。

在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí),，在堿性條件下（如 0.1 mol/L、PH 9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃ 包被過(guò)夜較為合適,。

但在某些試驗(yàn)中,，如用 LPS 或毒素蛋白包被時(shí)，用 PH 7.2～7.4 PBS 稀釋才是滿(mǎn)意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為 1～10 ug/ml,，而對(duì)某些病原微生物抗原以 5～20 ug/ml 較為合適,，但均應(yīng)通過(guò)滴定。