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*Z易懂的流式細胞實驗設(shè)計指南
閱讀：1050 發(fā)布時間：2018-5-8流式細胞術(shù)是非常讓人著迷的實驗。在眾多醫(yī)學(xué)研究手段里,，如果說弱水三千只取一瓢的話,，那我會選流式細胞術(shù)。從我個人感受來講,，流式細胞術(shù)高速客觀，具有統(tǒng)計學(xué)意義,，能夠處理復(fù)雜樣本并同時獲取多種參數(shù),，zuizui關(guān)鍵的是它性能可靠，可重復(fù)性非常好,。
雖然也存在一些局限,，但流式細胞術(shù)比起傳統(tǒng)的細胞生物學(xué)研究手段來講*可以獲得「獨孤求敗」的桂冠了,；如果算上共聚焦和膜片鉗，當真可以算拉動現(xiàn)代細胞生物學(xué)的「三駕馬車」了,。
雖然介紹流式細胞術(shù)的入門文章很多,，很多同學(xué)也對流式細胞術(shù)耳濡目染已久，看師兄師姐做過無數(shù),，可真到自己做的時候卻又總出問題,。據(jù)毛老師多年觀察，很多同學(xué)在實驗設(shè)計的時候就埋下了隱患,，zui常見的問題就是對照設(shè)置不合理,，zui后導(dǎo)致整體實驗失敗或數(shù)據(jù)不理想。因此,，今天我們來談?wù)劤晒Φ牧魇郊毎麑嶒炘O(shè)計都需要設(shè)置哪些對照,。
毫不夸張地說，設(shè)置合理的對照組是整個實驗成功的關(guān)鍵,；反過來說,，如果你掌握了流式實驗如何設(shè)置對照的精髓，對整個免疫學(xué)相關(guān)的實驗設(shè)計都會有極大地幫助,。
流式對照至少有 5 種：生物學(xué)對照,，空白對照，同型對照（Isotype control）,，補償對照（也叫單陽性對照）和 FMO 對照,，主要目的是為了避免出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果。下面我們以一個具體的凋亡實驗來看看如何設(shè)置對照組,。下圖是 Annexin V/PI 檢測凋亡的原理示意圖,。
比如有兩組細胞，一組給予藥物處理（Treat 組）,，一組給予 DMSO 溶劑（Vehicle 組）,，擬用 Annexin V/PI 檢測凋亡，我們來看看都需要設(shè)置哪些對照,。
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生物學(xué)對照
這個很容易理解,，也是很多同學(xué)zui早設(shè)立的對照。這里 Vehicle 組就是生物學(xué)對照組,?？赡芎芏嗤瑢W(xué)想象力就局限于此了，有了生物學(xué)對照就夠了唄,，還需要額外對照嗎,？答案是肯定的，別忘了流式細胞術(shù)也是一種免疫學(xué)實驗，下面我們繼續(xù)來設(shè)置對照,。
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空白對照
在流式上機檢測前,，我們還需準備額外一組細胞（正常或處理過的皆可）,，什么染料也不加,，作為空白對照。為什么要設(shè)置空白對照呢,？除了陽性熒光信號之外,，我們還需要排除樣本是否自帶熒光背景，所以要用空白對照來驗證在各個檢測通道上的信號是否都是陰性,。
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同型對照（Isotype control）
這個對照很多同學(xué)都比較陌生,。這個還得從抗體結(jié)構(gòu)說起。大家知道抗體是個 Y 字形的,，F(xiàn)ab 區(qū)域是特異性識別抗原的,。在做蛋白免疫印跡時，只需考慮 Fab 的特異性就可以了,，但是細胞的話稍微有點不同,，因為有些細胞，特別是免疫細胞（B 細胞,，T 細胞,，巨噬細胞等等），它們表面有 Fc 受體,，所以這個同型對照是為了評估抗體 Fc 段與靶細胞的結(jié)合情況,。如果還不懂的話請看下圖。
所以在做免疫細胞的流式檢測時,，我們通常都需要加入 Fc 受體封閉劑,，之后再加入目標抗體的 isotype 作為同型對照，來排除細胞 Fc 受體造成的假陽性結(jié)果,。一般試劑商都會告知該抗體需要使用哪種同型抗體,。
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補償對照（單陽性對照）
要理解這個對照，首先需要知道什么是熒光補償,。一圖勝前言,，下面這個示意圖說得比較明白。
簡單來說,，需要使用幾種顏色的抗體,，就需要設(shè)置幾種顏色的單陽性對照。這個對照可以用細胞來做,，也可以特殊的微球的來做,。這里嚴重推薦使用補償微球來作為補償對照，一是能節(jié)約時間和樣本，二是,，有時候自己做的單陽性對照效果不佳，陽性信號不強,，就失去了補償對照的意義了,。下圖是我用補償微球的效果。
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熒光減一（FMO,，F(xiàn)luorescence minus one）對照
如果只用到兩種顏色的話,，這個對照可以用單陽性對照代替，如果三種以上顏色的話,，就需要再設(shè)置 FMO 對照來評估其他熒光染料的干擾和補償本底,，幫助正確設(shè)置陽性門。
下圖演示如果按空白對照組設(shè)定界線之后得到的細胞比例比 FMO 設(shè)定的值要大,。從這個圖可以看出,，空白對照僅僅是設(shè)定陰性界線，但非陰性并不等于就是陽性,，所以還需 FMO 來設(shè)定陽性界線,。再打個比方，比如人體體溫正常是 37°,，小于 37° 肯定不是發(fā)熱,，那超過 37° 就一定是發(fā)熱嗎，比如 37.1°,？（發(fā)熱的診斷界線是 37.3°）,。
所以，綜上所述,，如果只檢測兩種顏色的話,，至少需要 5 個對照（生物學(xué)對照 + 空白對照 + 同型對照 + 2 個單陽性對照）。如果要檢測 3 種顏色的話,，我們來算算,，生物學(xué)對照 + 空白對照 + 同型對照（可以不同的 isotype 做在同一管里）+3 個單陽性對照 + 3 個 FMO 對照，一共需要 9 個對照,。
只有設(shè)置了合理的對照,，才能得到準確可靠的結(jié)果，小伙伴們 get 到了嗎,？下次再去做流式,，就不會被流式的老師懟得無地自容了吧。如果覺得對您有所啟發(fā),，請點個贊哦,，要是感興趣的同學(xué)比較多，我們下次再繼續(xù)談?wù)剺颖咎幚砗皖伾钆涞膯栴}。
zui后想提一點冷知識,，流式細胞術(shù)（Flowcytometry）是近年來流行起來的叫法,，但它和 FACS 嚴格來說不是同一個意思，F(xiàn)ACS 意思是 Fluorescence activated Cell Sorting,，以前老一輩們都叫熒光激發(fā)細胞分選實驗,，S 是分選的意思，但實際上很多流式細胞儀還只能做到檢測分析,，不能實現(xiàn)分選,，我們只是習(xí)慣用 FACS 來指代流式細胞檢測術(shù)而已。