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實(shí)驗(yàn)材料    蛋白質(zhì)樣品
試劑,、試劑盒    裂解液PBSG 250考馬斯亮藍(lán)溶液NaCl SDS上樣緩沖液電泳緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液麗春紅染液封閉液TBSTTBS洗脫抗體緩沖液顯影液定影液抗體化學(xué)發(fā)光試劑
儀器,、耗材    高壓鍋玻璃勻漿器高速離心機(jī)分光光度儀-20℃低溫冰箱垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置恒溫水浴搖床多用脫色搖床
實(shí)驗(yàn)步驟    
一,、操作步驟：

1. 蛋白樣品制備

（1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

① 倒掉培養(yǎng)液,，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）,。

② 每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1 min 洗滌細(xì)胞,，然后棄去洗液,。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液,。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上,。

③ 按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上,。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合,。）

④ 每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng),。

⑤裂解完后,，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml 離心管中,。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行,。）

⑥于4℃下12000 rpm離心5 min 。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

⑦將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 min 的離心管中放于-20℃保存,。

（2） 組織中總蛋白的提取：

① 將少量組織塊置于1～2 ml 勻漿器中球狀部位,，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎,。

② 加400 ?l單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿,。然后置于冰上,。

③ 幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎,。

④ 裂解30 min后,，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml 離心管中，然后在4℃下12000 rpm 離心5 min ,，取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存,。

（3） 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響,，一些細(xì)胞脫落下來,，所以除按（1）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

① 將培養(yǎng)液倒至1.5 ml 離心管中,，于2500 rpm 離心5 min。

②棄上清,，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,，然后2500 rpm 離心5 min 。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次,。

③ 用槍洗干上清后,，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解,。

④ 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃,、12000 rpm 離心5 min，取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存,。

2. 蛋白含量的測定

（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

①從-20℃取出1 mg/ml BSA,，室溫融化后，備用,。

②取18個(gè)1.5 ml 離心管,，3個(gè)一組,，分別標(biāo)記為 0 μg，2.5 μg,，5.0 μg ,，10.0 μg ，20.0 μg ,，40.0μg,。
 
③按下表在各管中加入各種試劑。
     0 μg    2.5 μg    5.0 μg    10.0 μg    20.0 μg    40.0 μg
1mg/ml BSA    ——    2.5 μl    5.0 μl    10.0 μl    20.0 μl    40.0 μl
0.15mol/L NaCl    100 μl    97.5 μl    95.0 μl    90.0 μl    80.0 μl    60.0 μl
G250考馬斯亮藍(lán)溶液    1 ml    1 ml    1 ml    1 ml    1 ml    1 ml
 
④混勻后,，室溫放置2 min ,。在生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析,。
 
（2） 檢測樣品蛋白含量

①取足量的1.5 ml 離心管,，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml 。室溫放置30 min后即可用于測蛋白,。

②取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 μl,，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品,。

③棄空白樣品,，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 ml），再用無菌水洗一次,。

④取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 μl待測蛋白樣品,，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品,。

注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次,，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測,，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5 μl樣品含的蛋白量,。

3. SDS－PAGE電泳

（1） 清洗玻璃板：

一只手扣緊玻璃板,，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖,，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干,。

（2） 灌膠與上樣

①玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠,。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊,，以免漏膠。）

②按前面方法配10%分離膠,，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠,。灌膠時(shí),，可用10 ml 槍吸取5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可,。然后膠上加一層水,，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些,，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度,。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡,。加水液封時(shí)要很慢,，否則膠會(huì)被沖變型。）

③當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),，說明膠已凝了。再等3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干,。

④按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠,。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生,。插梳子時(shí)要使梳子保持水平,。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小,，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠,。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,。

⑤用水沖洗一下濃縮膠,，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi),，大玻璃板面向外,。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外,。）

⑥測完蛋白含量后,，計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml 離心管中,，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×,。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品,。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性,。

⑦加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡,。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔,，若有氣泡也可能使樣品溢出,。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,，以免交叉污染,。

（3） 電泳
電泳時(shí)間一般4～5 h，電壓為40 V較好,，也可用60 V,。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。

4. 轉(zhuǎn)膜

（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜,。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜,。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用,。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上,，只有下層才與水接觸,。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里,，膜與水之間形成一層空氣膜,，這樣會(huì)阻止膜吸水。

（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子,、兩塊海綿墊,、一支玻棒、濾紙和浸過的膜,。

（3） 將夾子打開使黑的一面保持水平,。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡,。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng),。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），
一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡,。

（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬,。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng),，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂,。）除去小玻璃板后,，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破,。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡,。將膜蓋于膠上,，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡,。zui后蓋上另一個(gè)海綿墊,，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,，要不斷的搟去氣泡,。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路,。（轉(zhuǎn)移液含甲醇,，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通,。）

（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面,，夾的白面對槽的紅面,。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫,。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h,。

（6） 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白,。 將膜晾干備用,。   

5. 免疫反應(yīng)

（1） 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中,，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h,。

（2） 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml 離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上,，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整,；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜,，用濾紙吸去殘留液后,，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,，每次10 min；再用TBS洗一次,，10 min,。

（3） 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,，每次10 min；再用TBS洗一次,，10 min,，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

6. 化學(xué)發(fā)光,，顯影,，定影

（1） 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后,，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上,，去盡殘液,，包好，放入X-光片夾中,。

（2） 在暗室中,，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片,，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾,，把X－光片放在膜上,，一旦放上，便不能移動(dòng),，關(guān)上X-光片夾,，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,，一般為1 min或5 min,，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)*效果,；曝光完成后,，打開X-光片夾,，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影,，待出現(xiàn)明顯條帶后,，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2 min（20～25℃）,，溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間,；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中,，定影時(shí)間一般為5～10 min,，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后,，室溫下晾干,。

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角,，手指甲不要?jiǎng)潅z片,，否則會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生影響。

7. 凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值,。