用Agrisera抗PsbA抗體和PsbA蛋白標(biāo)準(zhǔn)對(duì)植物和藻類樣品中的PsbA進(jìn)行定量：

方法：植物樣品通常在研缽和杵中用液氮研磨,。產(chǎn)生的粉末被轉(zhuǎn)移到塑料管中。藻類樣品可以通過離心或 通過過濾到玻璃纖維過濾器上進(jìn)行濃縮,。在含有0.1mg/mL PefaBloc SC（AEBSF）蛋白酶抑制劑（羅氏）的Agrisera蛋白提取緩沖液（PEB,，AS08 300）中進(jìn)行增溶。通過在液氮中對(duì)樣品進(jìn)行快速冷凍,，并用微型針尖進(jìn)行超聲處理,，以交替解凍 地獲得破壞,。根據(jù)樣品的韌性,，可重復(fù)此過程。將樣品調(diào)節(jié)至50 mM二硫蘇糖醇并加熱至70°C 5分鐘,。在電泳前,，對(duì)樣品進(jìn)行短暫冷卻和離心。

根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的豐度,，使用每個(gè)凝膠通道的中等樣本量（總蛋白質(zhì)通常為0.5至2.5 ug）實(shí)現(xiàn) 定量,。

電泳和免疫印跡：一旦溶解，蛋白質(zhì)可以在許多系統(tǒng)中進(jìn)行電泳分離,。我們使用使用Bis-Tris 4-12%梯度凝膠的Invitrogen NuPAGE凝膠系統(tǒng)獲得zui佳結(jié)果,。根據(jù)制造商的建議，蛋白質(zhì)在MES SDS運(yùn)行緩沖液中在200 V下分離35分鐘,。凝膠在同一裝置（SureLock XCell blot module）中轉(zhuǎn)移至PVDF,，單個(gè)凝膠在30 V電壓下轉(zhuǎn)移60分鐘，成對(duì)凝膠轉(zhuǎn)移80分鐘,。轉(zhuǎn)移后,，用TBS-T中含量不超過10%的無脂奶粉將污漬堵塞1 h/RT，輕輕攪拌,。將印跡與一級(jí)抗體（通常為1:25 000至1:50 000）一起孵育1 h/RT（如果使用J端femtogram檢測(cè)試劑）,，或在較低的一級(jí)抗體稀釋液中孵育較低靈敏度的試劑（中等皮克和較低）。

對(duì)于定量而言,，相對(duì)較高的一抗：靶蛋白比率比一抗：靶蛋白比率較低的免疫印跡法提供更可靠的結(jié)果,。

在TBS-T中廣泛清洗污漬（兩次短暫，一次15分鐘,，三次5分鐘）,。將印跡與二級(jí)抗體（例如山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物AS09 602（Agrisera））孵育1h/RT。如上所述清洗印跡并使用ECL檢測(cè)試劑顯影,。

定量：當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)包括在印跡上時(shí),，可使用可用軟件對(duì)樣品進(jìn)行定量,。使用Bio-Rad Fluor-S-Max或使用Bio-Rad QuantityOne軟件的同等儀器上采集的圖像可獲得J好的定量。輪廓工具用于選擇定量區(qū)域,，并減去背景值,，得出每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的調(diào)整體積（單位：計(jì)數(shù)）。使用上述協(xié)議,，在目標(biāo)負(fù)載的1-1.5個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)生成線性標(biāo)準(zhǔn)曲線,。需要注意的是，免疫檢測(cè)通常顯示強(qiáng)S形信號(hào)-負(fù)載響應(yīng)曲線,，低負(fù)載跟蹤檢測(cè)區(qū)域,、偽線性范圍和高負(fù)載飽和響應(yīng)區(qū)域。對(duì)于免疫定量而言,，樣本中的目標(biāo)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)曲線在偽線性范圍內(nèi)是至關(guān)重要的,。我們使用該協(xié)議的總檢測(cè)范圍超過2個(gè)數(shù)量級(jí)，但可量化范圍更窄,。

艾美捷 PsbA|D1 protein of PSII應(yīng)用實(shí)例：

在4-12%NuPage（Invitrogen）LDS-PAGE上分離（1-4和6-8）原綠球菌的2µg總蛋白,，用蛋白提取緩沖液PEB（AS08 300），（9-12）PsbA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（AS01 016S）,，（5）分子量標(biāo)記（魔術(shù)標(biāo)記,，Invitrogen）提取，并在PVDF上印跡1h,。在吐溫-20（TBS-T）中加入2%的封閉試劑攪拌1h/RT后,，立即封閉印跡。將印跡以1:50000的稀釋度在一級(jí)抗體中攪拌培養(yǎng)1h/RT,。傾析抗體溶液,，將印跡短暫沖洗兩次，然后在室溫下攪拌,，在TBS-T中洗滌一次15分鐘,，洗滌3次5分鐘。在二級(jí)抗體（抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物）中培養(yǎng)印跡,，稀釋至1:10000 in,，攪拌1h/RT。按照上述方法清洗印跡,，并根據(jù)制造商說明使用ECL檢測(cè)試劑顯影5分鐘,。使用CCD成像儀（FluorSMax，Bio-Rad）和Quantity One軟件（Bio-Rad）獲得斑點(diǎn)圖像,。在原綠球菌樣品中,，PsbA的各種較小的C-末端裂解產(chǎn)物很明顯；這些都是真實(shí)的，并且根據(jù)治療和生長(zhǎng)條件的不同,，它們的變化方式也不盡相同,。

Agrisera公司提供的植物領(lǐng)域的抗體涵蓋擬南芥、萊茵衣藻,、藍(lán)藻,、松柏類、硅藻,、大豆,、大麥、蒺藜苜蓿等等,。艾美捷科技是Agrisera的中國(guó)代理商,，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的PsbA|D1 protein of PSII。