丙酮酸是細胞代謝中的關(guān)鍵分子,。它是糖酵解的最終產(chǎn)物,，也是需氧和厭氧呼吸的初始步驟。在需氧條件下,，丙酮酸進入線粒體,，在那里它經(jīng)歷進一步的氧化，通過克雷布斯循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量豐富的分子,，如ATP,。或者,，在厭氧條件下,，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為乳酸，再生糖酵解繼續(xù)所需的輔因子NAD+,。丙酮酸還作為各種生物合成途徑的關(guān)鍵前體,，包括氨基酸和脂肪酸的合成。它在能量生產(chǎn)和生物合成中的核心作用使丙酮酸成為細胞過程中的基本分子,。AkrivisBio丙酮酸檢測是一種簡單敏感的方法,，用于定量從低于1μM到10mM范圍內(nèi)的丙酮酸，適用于各種生物樣本類型,。

艾美捷丙酮酸測定試劑盒：

貨號：MA-0129

孔數(shù)：100孔

樣本類型：組織提取物,、細胞裂解物、血清、血漿,、尿液,、其他生物液體

物種：所有物種

檢測方法：比色法，OD 570納米或熒光法,，激發(fā)/發(fā)射 = 535/580納米

檢測類型：定量

應(yīng)用：一種基于板的比色法/熒光法檢測,，用于在1 μM - 10 mM范圍內(nèi)定量各種生物樣本中的丙酮酸。

靈敏度：1 uM-10 mM

儲存條件：-20°C

運輸溫度：使用冰袋

丙酮酸測定試劑盒組分：

-檢測緩沖液25毫升WMMA-0129-A

-ADHP溶液200微升紅色MA-0129-B

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶凍干綠色MA-0129-C

-丙酮酸標準品100微升黃色MA-0129-D

儲存和處理：將所有組件儲存在-20°C,。使用前將其升至室溫,。打開前短暫離心小瓶。

-檢測緩沖液：使用前升至室溫,。儲存在4°C,。

-ADHP溶液：升至室溫以融化DMSO溶液?；旌暇鶆?，儲存在-20°C。

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶：加入220微升檢測緩沖液溶解,。儲存在-20°C,。

檢測方案：

1.標準曲線：

a.基于吸光度的檢測（樣本中約100μM–10mM）：通過將10微升標準品轉(zhuǎn)移到990微升檢測緩沖液中，將丙酮酸標準品稀釋至0.4mM,。

b.基于熒光的檢測（約0.2μM–100μM）：通過向990微升檢測緩沖液中添加10微升標準品,，然后將10微升轉(zhuǎn)移到90微升檢測緩沖液中，進一步稀釋丙酮酸標準品至最終濃度0.04mM,。

c.混合均勻,。將0–5–10–15–20–25微升加入96孔板中的一系列孔中。通過添加檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,，為比色法檢測提供0,2,4,6,8,10納摩爾/孔的丙酮酸標準品,。（熒光法檢測為0,200,400,600,800,1000皮摩爾/孔）。

2.樣本準備：用50微升檢測緩沖液勻漿組織（10毫克）或細胞（10^6）,。以16,000Xg離心5分鐘,，然后將5-50微升清澈上清液加入96孔板中的孔中。將唾液以16,000Xg離心5分鐘,，然后加入10微升到孔中,。可以直接向樣本孔中加入血清（10微升）,。用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,。

注意：

a.血清中的LDH活性可以將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。血清樣本應(yīng)儲存在-80°C,。解凍后立即使用,。

b.使用10kDa旋轉(zhuǎn)柱對樣本進行去蛋白處理，以去除可能消耗丙酮酸的酶。

c.一些樣本背景較高,。因此,，以雙份運行樣本，并使用配對孔確定背景,。

d.在極少數(shù)情況下,，內(nèi)源性化合物可能干擾酶反應(yīng)。使用配對樣本,，向其中一個測試樣本中添加內(nèi)標（吸光度2-5納摩爾,，熒光100皮摩爾），以準確測量丙酮酸（下面解釋的程序）,。

3.啟動反應(yīng)：為要運行的總孔數(shù)準備足夠的反應(yīng)混合物,。每個孔需要50微升含有以下成分的反應(yīng)混合物：

1）反應(yīng)混合物：

樣本/標準孔混合

背景對照混合

檢測緩沖液46微升（使用熒光時47.6微升）

ADHP溶液2微升（使用熒光時0.4微升）

丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶2微升

2）向每個含有丙酮酸標準品和測試樣本的孔中加入50微升反應(yīng)混合物。向背景孔中加入50微升背景對照混合,。

4.測量：使用微孔板讀取器在室溫下通過吸光度（570納米）或熒光（激發(fā)/發(fā)射=535/590納米）監(jiān)測反應(yīng)30分鐘,。

5.典型結(jié)果：

6.計算：從所有標準讀數(shù)中減去0標準讀數(shù)。繪制丙酮酸標準曲線并確定標準曲線的斜率,。該值將用于計算未知測試樣本中的丙酮酸。如果運行了背景對照孔,，則從每個配對未知樣本中減去背景讀數(shù),。將背景校正后的樣本信號除以標準曲線的斜率。這給出了孔中的納摩爾或皮摩爾丙酮酸,。

對于添加了內(nèi)標的樣本,，從未知樣本中減去添加了已知量丙酮酸的未知樣本。獲得的信號是系統(tǒng)對添加量的響應(yīng),。僅含有未知物的孔中丙酮酸的校正量={未知樣本信號/[（添加樣本信號-未知樣本信號）/添加量]}

要將孔中的量轉(zhuǎn)換為原始樣本中的丙酮酸量：

A.孔中的丙酮酸納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù),。

B.每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù)X樣本總體積（原始樣本+稀釋液體積）=樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)

C.樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)/組織毫克數(shù)（或細胞數(shù)或血清微升數(shù)等）=每毫克組織（細胞等）的丙酮酸納摩爾數(shù)。