脂肪酸是末端為羧酸的碳?xì)滏湣Ｋ鼈冏鳛槟芰縼碓?、結(jié)構(gòu)組分以及多種生物活性化學(xué)物質(zhì)（統(tǒng)稱為氧化脂質(zhì)）的前體,，在生物體內(nèi)具有重要作用，這些生物活性物質(zhì)具有多種生物學(xué)功能,，包括促炎和抗炎,、血管活性、自分泌和旁分泌功能,。AkrivisBio的游離脂肪酸檢測試劑盒提供了一種簡單、靈敏的方法,，用于測量多種生物樣本中的游離脂肪酸,。該檢測基于脂肪酸轉(zhuǎn)化為輔酶A衍生物，隨后被氧化,，同時生成化學(xué)計量的過氧化氫,，用于氧化ADHP，產(chǎn)生與脂肪酸含量成正比的顏色和熒光,。反應(yīng)中加入增強劑以促進顏色和熒光的發(fā)展,。

艾美捷游離脂肪酸測定試劑盒：

貨號：MA-0111

規(guī)格：100孔

樣本類型：組織提取液、細(xì)胞裂解液,、血清,、血漿、尿液,、其他生物流體

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測方法：比色法（檢測波長570納米）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長=535/587納米）

檢測類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法/熒光法檢測,，用于測量樣本中游離脂肪酸的濃度。

靈敏度：>2微摩爾

儲存條件：-20°C

運輸條件：凝膠冷藏包

游離脂肪酸測定試劑盒檢測組分：

-檢測緩沖液：25毫升，貨號WMMA-0111A

-ADHP溶液：200微升,，紅色,，貨號MA-0111B

-酰基輔酶合成酶：凍干粉,，藍(lán)色,，貨號MA-0111C

-酰基輔酶氧化酶/辣根過氧化物酶：凍干粉,，綠色,，貨號MA-0111D

-增強劑：200微升，紫色,，貨號MA-0111E

-棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品（1mM）：300微升,，黃色，貨號MA-0111F

游離脂肪酸測定試劑盒檢測原理：

1.脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；o酶A,。

2.酰基輔酶A被氧化,，生成過氧化氫,。

3.過氧化氫被過氧化物酶利用，將ADHP氧化為熒光素,，產(chǎn)生強烈的顏色和熒光,。

用戶自備材料：

-脂質(zhì)提取材料（參見AkrivisBioPI-0101脂質(zhì)提取試劑盒）

-Polytron或勻漿器

-濾器

儲存和處理：

將試劑盒儲存于-20°C。使用前將所有組分恢復(fù)至室溫,。

-ADHP溶液：DMSO在略低于室溫時會凍結(jié),。使用前必須恢復(fù)至室溫。儲存于-20°C,。

-?；o酶合成酶；?；o酶氧化酶/辣根過氧化物酶：用220微升去離子水復(fù)溶凍干酶并混合,。儲存于-20°C。

-棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品冷凍后可能會分成兩相,。為了使用,，將其置于熱水浴（約80-100°C）中加熱至高于80°C,，直至溶液超過其濁點,，變得非常渾濁。在加熱時渦旋混合,。隨著溶液冷卻,，它將再次變得清澈,。重復(fù)加熱/冷卻循環(huán)一次，標(biāo)準(zhǔn)品即可使用,。

檢測步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：

-比色法檢測（0-10納摩爾/孔范圍）：將0,、5、10,、15,、20、25微升的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板的多個孔中,。用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,。這樣每孔分別含有0、2,、4,、6、8,、10納摩爾的標(biāo)準(zhǔn)品,。

-熒光法檢測（<1納摩爾/孔）：將棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍至40微摩爾，方法是將50微升標(biāo)準(zhǔn)品加入450微升檢測緩沖液中,，然后將0,、5、10,、15,、20、25微升的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板的多個孔中,。用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,，這樣每孔分別含有0、200,、400,、600、800,、1000皮摩爾的標(biāo)準(zhǔn)品,。

2.樣本準(zhǔn)備：

-液體樣本可以直接加入96孔板中,，并用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,。未知樣本的響應(yīng)必須在所用標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。如果未知樣本超出此范圍,，則必須稀釋并重新運行,。

-細(xì)胞（10?）或組織（10毫克）用5%異丙醇/5%Tergitol溶液在小勻漿器中提取，然后過濾以去除不溶物和細(xì)胞碎片,。樣本已準(zhǔn)備好使用,。溶液可能呈渾濁狀,，但這不影響檢測。每個檢測使用1-20微升樣本,。

3.?；o酶合成：向所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中加入2微升酰基輔酶合成酶,?；旌喜⒎跤?span style="font-family: Calibri;">30分鐘（37°C）。

4.氧化和顯色反應(yīng)混合液：根據(jù)要運行的孔數(shù)（樣本和標(biāo)準(zhǔn)品）準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液,。每個孔準(zhǔn)備總共50微升的反應(yīng)混合液,，包含：

-檢測緩沖液：44微升

-酰基輔酶氧化酶/辣根過氧化物酶：2微升

-ADHP溶液：2微升

-增強劑：2微升

-向每個孔中加入50微升反應(yīng)混合液,。在37°C下孵育反應(yīng)30分鐘,，避光。通過在微孔板讀數(shù)器中以動力學(xué)模式測量反應(yīng)進程,，觀察顏色或熒光的發(fā)展是有用的,。

5.測量：通過比色法（570納米吸光度）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長=535/587納米）監(jiān)測反應(yīng)進程。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的信號不再變化時,，反應(yīng)完成,。達(dá)到終點的時間應(yīng)少于30分鐘。

6.典型結(jié)果：

7.計算：從所有讀數(shù)中減去0納摩爾標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。斜率定義了系統(tǒng)的靈敏度（吸光度/納摩爾游離脂肪酸）。將背景校正后的樣本讀數(shù)除以斜率,，以確定游離脂肪酸的納摩爾含量,。將結(jié)果轉(zhuǎn)換回原始樣本中的含量：

-原始游離脂肪酸含量=從標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和未知吸光度確定的納摩爾數(shù)，校正稀釋：

-1.確定的納摩爾游離脂肪酸/加入孔中的樣本體積=樣本中的游離脂肪酸納摩爾/微升

-2.樣本中的游離脂肪酸納摩爾/微升×樣本總體積=樣本中的總游離脂肪酸納摩爾

-3.樣本中的總游離脂肪酸納摩爾/細(xì)胞數(shù)量或組織毫克數(shù)=每細(xì)胞或每毫克組織的游離脂肪酸納摩爾