SiR-微管蛋白基于硅羅丹明（SiR）熒光團和微管結合藥物多西他賽。SiR-微管蛋白能夠以高特異性和低背景在活細胞中標記微管（1）,。SiR-微管蛋白的關鍵特性包括：i）遠紅光吸收和發(fā)射波長,；ii）細胞通透性；iii）熒光生成特性,；iv）與超分辨率顯微鏡（STED和SIM）的兼容性,。這些特性在一個探針中的d特組合使SiR-微管蛋白處于優(yōu)質前沿。

艾美捷SiR-微管蛋白試劑盒（#CY-SC002）物理特性：

吸收波長（λabs）：652 nm

發(fā)射波長（λem）：674 nm

652 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε）：1.0×10? mol?1·cm?1

分子量（MW）：1303.6 g/mol

分子式（MF）：C₇₃H₈₆N₄O₁₆S

儲存與操作：

收到后將化合物儲存于-20°C以下,。使用無水DMSO配制化合物溶液,。使用后將化合物溶液儲存于-20°C以下。在打開前,，應將小瓶恢復至室溫,。如果儲存得當，化合物應可在數(shù)月內保持穩(wěn)定,。注意：DMSO溶液應特別小心處理,，因為DMSO已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關的當?shù)匾?guī)定處理這些試劑,。

標記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的人類成纖維細胞優(yōu)化的,，并已在其他常見細胞系中得到驗證。實驗協(xié)議的建議應作為起點,，每種細胞類型的優(yōu)標記條件應通過實驗確定,。SiR-微管蛋白基于微管穩(wěn)定藥物多西他賽，因此可以改變活細胞中微管的動態(tài),。盡管間期細胞受探針影響較小,，但在培養(yǎng)的HeLa細胞中，超過100 nM的SiR-微管蛋白濃度會導致有絲分裂期延長（1）,。如果計劃進行長期成像實驗且微管動態(tài)至關重要,，建議將SiR-微管蛋白的濃度保持在100 nM或以下。對于其他用途,，建議使用1 µM的SiR-微管蛋白進行染色,。

1. 配制1 mM儲備液：將SiR-微管蛋白小瓶的內容物溶解在50 µL無水DMSO中，制備1 mM儲備液,。該溶液應儲存于-20°C或更低溫度,。不要將溶液分裝成小份，因為它們會更快降解,，且該化合物不會因多次凍融循環(huán)而改變,。如果儲存得當,，該儲備液應可在三個月或更長時間內保持穩(wěn)定。如果需要準確測定儲備液的濃度,，可將1 µL 1 mM儲備液稀釋在99 µL含有0.2% SDS的PBS中,。在室溫下靜置15分鐘后，在652 nm處測量吸光度,。使用上述給定的消光系數(shù)計算濃度,。

2. 配制染色液：在細胞培養(yǎng)基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中將SiR-微管蛋白稀釋至所需濃度，并短暫渦旋,。由于染色效率可能因細胞系而異,，建議s次嘗試時使用1 µM濃度以快速獲得強染色效果，然后在后續(xù)實驗中降低SiR-微管蛋白濃度,，直至獲得最佳染色效果（參見下表中的標記濃度和孵育時間）,。某些細胞系可能表達高水平的外排泵，因此SiR-微管蛋白染色效果較差,。在染色液中加入10 µM維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通?？梢燥@著改善染色效果。

3. 細胞準備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片,、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細胞,。當細胞達到所需密度時，用染色液替換培養(yǎng)基,，確保所有細胞都被溶液覆蓋,。將細胞置于37°C、含5% CO?的濕潤環(huán)境中孵育,，并根據(jù)標記時間作為探針濃度的函數(shù),。

*標記時間是針對人類成纖維細胞確定的，可能會因使用的細胞系而有所不同,。

重要提示：SiR-微管蛋白不能染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的細胞,，因為這些固定方法會改變微管上探針的結合位點。

細胞成像：使用標準Cy5設置對SiR-微管蛋白進行成像效果佳,。標記后,，活細胞可以立即成像，無需洗滌步驟,?？蛇x地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標記液通?？梢蕴岣咝旁氡?。如果進行時間序列成像，建議在整個實驗過程中將探針濃度保持在100 nM或以下，以獲得穩(wěn)定的信號并避免探針干擾微管動態(tài)（延長有絲分裂期和降低細胞增殖）,。如果在成像前對細胞進行了洗滌,，染色效果將持續(xù)數(shù)小時。

文獻參考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavi?ius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)