Flipper-TR是一種熒光探針,，能夠特異性靶向細胞的質膜，并通過其熒光壽命的變化報告膜張力的變化,。它是Flipper探針家族中優(yōu)良的成員（參見文獻2和3）,，通過機械感受基團中兩個扭曲的二噻吩并噻吩之間的扭轉角度和偏振的變化來感知脂質雙層膜的組織變化。Flipper-TR能夠自發(fā)地插入細胞的質膜中,，并且只有在插入脂質膜時才會發(fā)出熒光,。它具有寬吸收和發(fā)射光譜，通?？梢杂?span style="font-family: Calibri;">488 nm激光進行激發(fā),，而發(fā)射光則在575至625 nm之間收集。Flipper-TR適用于多種生物體,，包括細菌,、酵母、哺乳動物和植物,。

艾美捷Flipper TR膜張力傳感器（CY-SC020）光物理特性：

- 吸收波長（λabs）：480 nm

- 發(fā)射波長（λem）：600 nm

- 大摩爾吸光系數(shù)（εmax）：1.66×10? mol?1·cm?1（DMSO中）

- 熒光壽命：2.8 - 7 ns

- 量子產率（QY）：30%（乙酸乙酯中）

Flipper TR膜張力傳感器的作用機制示意圖：

圖：左側為Flipper-TR分子的示意圖,。中間為低張力脂質雙層，其中Flipper呈扭曲狀態(tài),；右側為探針呈平面狀態(tài),。

儲存與操作：

收到后將探針儲存于-20°C。使用新鮮且無水的DMSO配制探針溶液（因為陳舊和含水的DMSO會顯著縮短探針的保質期）,。使用后將探針溶液儲存于-20°C,。在打開前，應將小瓶恢復至室溫,。如果儲存得當,，溶液中的探針應可在3個月內保持穩(wěn)定。注意：DMSO溶液應特別小心處理,，因為DMSO已知會促進有機分子進入組織,。請按照所有相關的當?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

標記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的HeLa細胞優(yōu)化的,，并已在其他常見細胞系中得到驗證,。實驗協(xié)議的建議應作為起點，每種細胞類型的優(yōu)標記條件應通過實驗確定,。

1. 配制1 mM儲備液：將Flipper-TR小瓶的內容物溶解在50 µL無水DMSO中,，制備1 mM儲備液。該溶液應儲存于-20°C或更低溫度,。不要將溶液分裝成小份,，因為它們會更快降解，且該化合物不會因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲存得當,，該儲備液應可在三個月內保持穩(wěn)定,。（可選）如果需要準確測定儲備液的濃度，可將1 µL 1 mM儲備液稀釋在99 µL DMSO中,。在425 nm處測量吸光度,。使用上述給定的消光系數(shù)計算濃度。

2. 配制染色液：在應用于細胞之前,，將Flipper-TR稀釋至所需濃度（從1 µM開始）的細胞培養(yǎng)基中（不要在使用前保存染色液超過2小時）,。注意：當使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的細胞培養(yǎng)基時，與不含血清的培養(yǎng)基相比,，標記效率可能會降低,。如果觀察到信號較低，可以將探針濃度增加至2 µM,。

3. 細胞準備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片,、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細胞。當細胞達到所需密度時,，用染色液替換培養(yǎng)基,，確保所有細胞都被溶液覆蓋。將細胞置于37°C,、含5% CO?的濕潤環(huán)境中孵育15分鐘,，然后進行成像。30分鐘或更長時間后,，由于膜的周轉,，可能會觀察到內質網結構的標記,。然而,，其他含有膜的細胞器（內質網、高爾基體）的標記是有限的,。內質網結構通常具有較短的壽命,。可選地,，可以移除含有探針的培養(yǎng)基,，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞一次。由于探針僅在膜中具有熒光,，因此不需要移除探針,，特別是在計劃進行長期成像（>24小時）且培養(yǎng)基中含有血清的情況下。在低于1 µM的探針濃度下,，與探針孵育2-3天后未觀察到對細胞活力的影響

4. FLIM成像：使用標準的FLIM顯微鏡對細胞進行成像,，使用485 nm或488 nm脈沖激光進行激發(fā)，并通過600/50 nm帶通濾光片收集光子。我們建議優(yōu)化標記程序以及圖像采集設置,，以盡量減少488 nm激發(fā)光對活樣本的光損傷,。為了提取壽命信息，將感興趣區(qū)域（ROI）或單像素（積累足夠計數(shù)以確保良好統(tǒng)計）的光子直方圖擬合為雙指數(shù),，并提取兩個衰減時間τ?和τ?,。具有較高擬合振幅的長壽命τ?用于報告膜張力，其值在2.8至7.0 ns之間,。壽命越長,，膜的張力越大。τ?的值較?。ㄔ?span style="font-family: Calibri;">0.5至2 ns之間）,，且擬合振幅較小，不太適合用于研究膜張力,?？梢允褂脜⒖嘉墨I1中給出的校準程序將壽命與絕對膜張力相關聯(lián)。

重要注意事項：

- 只能通過FLIM顯微鏡進行膜張力測量,，熒光強度或波長不能可靠地報告膜張力,。

- 隨時間變化脂質組成的系統(tǒng)也可能導致Flipper-TR壽命的變化。

- FLIM成像是一種高級顯微鏡技術,，需要配備適當?shù)募ぐl(fā)激光器,、光子計數(shù)系統(tǒng)和發(fā)射濾光片的商業(yè)或定制FLIM顯微鏡系統(tǒng)。建議客戶咨詢其儀器負責人或聯(lián)系顯微鏡制造商,，以確保其系統(tǒng)能夠成像Flipper-TR的熒光和壽命,。

文獻參考：

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.