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Flipper TR膜張力傳感器光物理特性和作用機(jī)制分析

時(shí)間:2025/3/26閱讀:93
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Flipper-TR是一種熒光探針,,能夠特異性靶向細(xì)胞的質(zhì)膜,并通過(guò)其熒光壽命的變化報(bào)告膜張力的變化,。它是Flipper探針家族中優(yōu)良的成員(參見(jiàn)文獻(xiàn)23),,通過(guò)機(jī)械感受基團(tuán)中兩個(gè)扭曲的二噻吩并噻吩之間的扭轉(zhuǎn)角度和偏振的變化來(lái)感知脂質(zhì)雙層膜的組織變化。Flipper-TR能夠自發(fā)地插入細(xì)胞的質(zhì)膜中,,并且只有在插入脂質(zhì)膜時(shí)才會(huì)發(fā)出熒光,。它具有寬吸收和發(fā)射光譜,通??梢杂?span style="font-family: Calibri;">488 nm激光進(jìn)行激發(fā),,而發(fā)射光則在575625 nm之間收集。Flipper-TR適用于多種生物體,,包括細(xì)菌,、酵母、哺乳動(dòng)物和植物,。

 

艾美捷Flipper TR膜張力傳感器CY-SC020光物理特性:

吸收波長(zhǎng)(λabs):480 nm

發(fā)射波長(zhǎng)(λem):600 nm

大摩爾吸光系數(shù)(εmax):1.66×10mol?1·cm?1(DMSO中)

熒光壽命:2.8 - 7 ns

量子產(chǎn)率(QY):30%(乙酸乙酯中)

 

Flipper TR膜張力傳感器的作用機(jī)制示意圖

11.png

圖:左側(cè)為Flipper-TR分子的示意圖,。中間為低張力脂質(zhì)雙層,其中Flipper呈扭曲狀態(tài),;右側(cè)為探針呈平面狀態(tài),。

 

儲(chǔ)存與操作:

收到后將探針儲(chǔ)存于-20°C。使用新鮮且無(wú)水的DMSO配制探針溶液(因?yàn)殛惻f和含水的DMSO會(huì)顯著縮短探針的保質(zhì)期),。使用后將探針溶液儲(chǔ)存于-20°C,。在打開(kāi)前,應(yīng)將小瓶恢復(fù)至室溫,。如果儲(chǔ)存得當(dāng),,溶液中的探針應(yīng)可在3個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意:DMSO溶液應(yīng)特別小心處理,,因?yàn)?span style="font-family: Calibri;">DMSO已知會(huì)促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織,。請(qǐng)按照所有相關(guān)的當(dāng)?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

 

標(biāo)記協(xié)議:

注意:本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的HeLa細(xì)胞優(yōu)化的,,并已在其他常見(jiàn)細(xì)胞系中得到驗(yàn)證,。實(shí)驗(yàn)協(xié)議的建議應(yīng)作為起點(diǎn),每種細(xì)胞類型的優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定,。

1. 配制1 mM儲(chǔ)備液:將Flipper-TR小瓶的內(nèi)容物溶解在50 µL無(wú)水DMSO中,,制備1 mM儲(chǔ)備液,。該溶液應(yīng)儲(chǔ)存于-20°C或更低溫度。不要將溶液分裝成小份,,因?yàn)樗鼈儠?huì)更快降解,,且該化合物不會(huì)因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲(chǔ)存得當(dāng),,該儲(chǔ)備液應(yīng)可在三個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定,。(可選)如果需要準(zhǔn)確測(cè)定儲(chǔ)備液的濃度,可將1 µL 1 mM儲(chǔ)備液稀釋在99 µL DMSO中,。在425 nm處測(cè)量吸光度,。使用上述給定的消光系數(shù)計(jì)算濃度。

2. 配制染色液:在應(yīng)用于細(xì)胞之前,,將Flipper-TR稀釋至所需濃度(從1 µM開(kāi)始)的細(xì)胞培養(yǎng)基中(不要在使用前保存染色液超過(guò)2小時(shí)),。注意:當(dāng)使用含有胎牛血清(FCS)或其他血清的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí),與不含血清的培養(yǎng)基相比,,標(biāo)記效率可能會(huì)降低,。如果觀察到信號(hào)較低,可以將探針濃度增加至2 µM,。

3. 細(xì)胞準(zhǔn)備和染色:按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞,。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí),,用染色液替換培養(yǎng)基,確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋,。將細(xì)胞置于37°C,、含5% CO?的濕潤(rùn)環(huán)境中孵育15分鐘,然后進(jìn)行成像,。30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后,,由于膜的周轉(zhuǎn),可能會(huì)觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記,。然而,,其他含有膜的細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體)的標(biāo)記是有限的,。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)通常具有較短的壽命,。可選地,,可以移除含有探針的培養(yǎng)基,,并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。由于探針僅在膜中具有熒光,,因此不需要移除探針,特別是在計(jì)劃進(jìn)行長(zhǎng)期成像(>24小時(shí))且培養(yǎng)基中含有血清的情況下,。在低于1 µM的探針濃度下,,與探針?lè)跤?span style="font-family: Calibri;">2-3天后未觀察到對(duì)細(xì)胞活力的影響

4. FLIM成像:使用標(biāo)準(zhǔn)的FLIM顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像,使用485 nm488 nm脈沖激光進(jìn)行激發(fā),,并通過(guò)600/50 nm帶通濾光片收集光子,。我們建議優(yōu)化標(biāo)記程序以及圖像采集設(shè)置,以盡量減少488 nm激發(fā)光對(duì)活樣本的光損傷,。為了提取壽命信息,,將感興趣區(qū)域(ROI)或單像素(積累足夠計(jì)數(shù)以確保良好統(tǒng)計(jì))的光子直方圖擬合為雙指數(shù),并提取兩個(gè)衰減時(shí)間τ?和τ?,。具有較高擬合振幅的長(zhǎng)壽命τ?用于報(bào)告膜張力,,其值在2.87.0 ns之間。壽命越長(zhǎng),,膜的張力越大,。τ?的值較小(在0.52 ns之間),,且擬合振幅較小,,不太適合用于研究膜張力??梢允褂脜⒖嘉墨I(xiàn)1中給出的校準(zhǔn)程序?qū)勖c絕對(duì)膜張力相關(guān)聯(lián),。

 

重要注意事項(xiàng):

只能通過(guò)FLIM顯微鏡進(jìn)行膜張力測(cè)量,熒光強(qiáng)度或波長(zhǎng)不能可靠地報(bào)告膜張力,。

隨時(shí)間變化脂質(zhì)組成的系統(tǒng)也可能導(dǎo)致Flipper-TR壽命的變化,。

- FLIM成像是一種高級(jí)顯微鏡技術(shù),需要配備適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)激光器,、光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)和發(fā)射濾光片的商業(yè)或定制FLIM顯微鏡系統(tǒng),。建議客戶咨詢其儀器負(fù)責(zé)人或聯(lián)系顯微鏡制造商,以確保其系統(tǒng)能夠成像Flipper-TR的熒光和壽命,。

 

文獻(xiàn)參考:

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:11181125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.


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