Nephrin（足蛋白）是一種在足細(xì)胞中表達(dá)的跨膜蛋白，足細(xì)胞是覆蓋在腎小球基底膜外側(cè)的臟層上皮細(xì)胞,。這些細(xì)胞具有交錯(cuò)的足突,，形成裂孔隔膜,，調(diào)節(jié)血漿蛋白通過腎小球屏障的通過,，因此發(fā)揮過濾功能。Nephrin基因突變,、Nephrin產(chǎn)生異常以及足細(xì)胞功能異常均會導(dǎo)致蛋白尿，這種情況常見于影響腎小球的疾病,，如腎病綜合征和糖尿病,。腎臟損傷可能伴隨Nephrin釋放和/或足細(xì)胞脫落進(jìn)入尿液。動物和糖尿病患者的研究支持Nephrin尿是腎臟損傷和疾病中腎小球損傷的標(biāo)志物,，并且可能反映損傷的嚴(yán)重程度,。檢測尿液中的Nephrin可能有助于早期發(fā)現(xiàn)腎功能異常和/或評估腎臟對治療干預(yù)的反應(yīng)。

艾美捷Ethos Biosciences-人Nephrin ELISA試劑盒【#1035】使用人Nephrin（hNephrin）作為標(biāo)準(zhǔn)品,，并采用針對人Nephrin N端的鼠單克隆抗體,。這種抗體不會與人白蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。人Nephrin ELISA是一種間接競爭性ELISA,，結(jié)果以ug/ml hNephrin報(bào)告,。檢測板預(yù)先涂有hNephrin。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本分別加入相應(yīng)的孔中,。加入抗hNephrin抗體,，該抗體與固定相的Nephrin或流動相中的Nephrin結(jié)合，因此稱為競爭性結(jié)合,。然后洗去未結(jié)合的反應(yīng)物,，并與抗小鼠IgG HRP偶聯(lián)物完成反應(yīng)。偶聯(lián)物與結(jié)合到固相抗原的抗體結(jié)合,，用酶標(biāo)記它,。洗去后，加入顯色底物,。經(jīng)過短暫孵育后,，用酸終止反應(yīng)。檢測中的顏色強(qiáng)度與初始流動相中人Nephrin濃度的對數(shù)成反比,。人Nephrin ELISA是一種用于測量人尿液樣本中Nephrin的競爭性ELISA,，僅供研究目的。

樣本采集與儲存：采集不含防腐劑的尿液樣本,。冷凍并儲存于-60°C,，最長可達(dá)2個(gè)月。檢測前,，讓樣本恢復(fù)至室溫,。解凍冷凍樣本時(shí)不要加熱。樣本應(yīng)混合均勻，并靜置至少15分鐘,，以便顆粒沉降,。

人Nephrin ELISA試劑盒組成：

- 1塊人Nephrin檢測板

- 2瓶EIA稀釋液

- 1瓶人Nephrin標(biāo)準(zhǔn)品

- 1瓶抗人Nephrin小鼠單克隆抗體（抗體）

- 1瓶抗小鼠IgG HRP偶聯(lián)物

- 1瓶TMB顯色劑

- 1瓶酸性顯色終止液

- 1份說明書

人Nephrin檢測板已預(yù)先涂覆，可直接使用,。試劑盒中的所有試劑均以即用型液體形式提供,。

所需材料和設(shè)備（試劑盒中未包含）：

- 洗滌緩沖液：Ethos Biosciences EIA洗滌緩沖液效果良好。含0.05% Tween 20的PBS也可接受,。水是不可接受的,。

- 微量移液器和多通道移液器及吸頭

- 稀釋用試管（Microfuge試管效果良好）

- 需要配備450 nm吸光度測量功能的酶標(biāo)儀

檢測程序：

在運(yùn)行檢測前，讓試劑恢復(fù)至室溫,。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本應(yīng)輕輕混合,，然后靜置至少15分鐘，以便顆粒沉降,。這些說明旨在使用每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)稀釋度和每個(gè)樣本稀釋度的雙孔完成檢測,。這種設(shè)計(jì)允許包含對照、標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并可分析多達(dá)40個(gè)樣本,。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：

此程序描述了制備七個(gè)（7）倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的過程：

1. 標(biāo)記1-7號試管。

2. 向每支試管中加入120 µL EIA稀釋液,。

3. 將120 µL人Nephrin標(biāo)準(zhǔn)品加入1號試管,。

4. 通過吸放液體5次混合內(nèi)容物。

5. 將120 µL從1號試管轉(zhuǎn)移到2號試管,。

6. 按上述方法混合,。

7. 繼續(xù)操作至7號試管。

8. 現(xiàn)在1-7號試管中含有代表2.0-0.0313 µg/ml人Nephrin的稀釋液,。

文獻(xiàn)參考：

1. Putaala, H et al: The murine nephrin gene is specifically expressed in kidney, brain and pancreas: inactivation of the gene leads to massive proteinuria and death. Hum Mol Genet 10:1-8,2001

2. Putaala, H. et al: Primary structure of mouse and rat nephrin cDNA and structure and expression of the mouse gene. J Am Soc Nephrol 11:991-1001, 2000

3. Holtzman, LB et al: Nephrin localizes to the slit pore of the glomerular epithelial cell. Kidney Int 56:1481-1491, 1999

4. Routsalainen, V et al: Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proc Natl Acad Sci USA 96:7962-7967, 1999

5. Holthofer, H et al: Nephrin localizes at the podocyte filtration area and is characteristically spliced in the human kidney. Am J Pathol 155:1681-1687, 1999

6. Kestila, M et al: Positionally cloned gene for novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome.Mol Cell 1:575-582, 1998

艾美捷科技是Ethos Biosciences的中國代理商,，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。