N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物RNA分子上Z常見和Z豐富的修飾,。m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體METTL3催化，并通過m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5去除,，這些酶以α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的方式催化m6A去甲基化,。已知METTL3、FTO和ALKBH5在許多生物過程中發(fā)揮重要作用,，包括發(fā)育,、代謝和生育,。m6A占所有RNA堿基甲基化的80%以上,，存在于不同物種中。m6A主要分布在mRNA中,，也出現(xiàn)在非編碼RNA中,，如tRNA、rRNA和snRNA,。m6A在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的相對豐度已被證明可以影響RNA代謝過程,，如剪接,、核輸出、翻譯能力和穩(wěn)定性以及RNA轉(zhuǎn)錄,。由于m6A RNA甲基化酶和去甲基化酶缺陷引起的m6A甲基化水平異?？赡軐?dǎo)致RNA功能障礙并引起疾病。例如,，由于FTO突變患者中FTO活性增加,，通過尚未定義的途徑，目標(biāo)mRNA中m6A水平異常低,，有助于肥胖及相關(guān)疾病的發(fā)生,。RNA上動態(tài)可逆的化學(xué)m6A修飾也可能作為具有深遠(yuǎn)生物學(xué)意義的新表觀遺傳標(biāo)記。因此,，更多有助于更好理解m6A RNA甲基化水平和分布的有用信息,，可以促進(jìn)疾病的診斷和治療。

目前,，有幾種方法用于表觀轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A定位,。這些方法包括MeRIP-seq、PA-m6A-seq,、miCLIP和m6A-CLIP,。MeRIP-seq已被廣泛使用，但無法實(shí)現(xiàn)m6A分析的高分辨率,。PA-m6A-seq,、miCLIP和m6A-CLIP提高了分析分辨率，但存在可重復(fù)性差和過程復(fù)雜的問題,。特別是,，這些方法耗時（>2天）且成本高。

為了解決這些問題,，EpigenTek開發(fā)了一種新方法：CUT&RUN RNA m6A-Seq（在目標(biāo)下切割并使用核酸酶回收用于m6A測序）,。我們的創(chuàng)新方法結(jié)合了MeRIP和m6A-CLIP的優(yōu)勢，具有z快的程序,，并將其整合到EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒中,。

艾美捷 EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒（P-9016）特點(diǎn)：

1、高富集度：使用RNA切割酶混合液同時切割RNA,，并在目標(biāo)m6A含有序列的兩端切割/移除任何RNA序列,，而不會影響抗體占據(jù)的RNA區(qū)域。僅與抗m6A抗體結(jié)合的短RNA片段被生成,。因此,，可以可靠地識別真正的目標(biāo)m6A富集區(qū)域，并實(shí)現(xiàn)高分辨率定位,。

2,、低輸入量：未結(jié)合的RNA切割和免疫捕獲在同一個管中進(jìn)行,，這使得目標(biāo)m6A含有區(qū)域得到一定程度的保護(hù)，同時Z小化樣本損失,，允許輸入RNA低至500納克,。

3、Z小背景：在目標(biāo)m6A含有序列的兩端切割未結(jié)合的RNA序列,，能夠Z小化MeRIP/測序背景,，允許數(shù)據(jù)分析時讀取數(shù)少于1000萬次。

4,、快速,、簡化的程序：從RNA到cDNA庫的程序少于6小時，且操作時間少于1小時,。

5,、高度方便：試劑盒包含CUT&RUN RNA m6A-Seq的每個步驟所需的所有組分，這些組分足以進(jìn)行m6A含有RNA序列捕獲和捕獲的cDNA庫制備,，因此使CUT&RUN RNA m6A-Seq成為Z方便,、可靠且結(jié)果一致的方法。

CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒檢測原理：

EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒包含了從總RNA開始進(jìn)行成功的m6A-Seq所需的所有必要試劑,。在反應(yīng)中,，目標(biāo)m6A含有區(qū)域兩端的RNA序列被切割/移除，并且使用結(jié)合有m6A捕獲抗體的珠子捕獲目標(biāo)m6A含有片段,。然后,，目標(biāo)m6A含有的RNA片段被回收、釋放,、逆轉(zhuǎn)錄,，并連接接頭。連接后的第一條鏈cDNA被擴(kuò)增,，然后用作文庫合成的模板,。使用高保真PCR混合液進(jìn)行文庫cDNA的擴(kuò)增和索引。然后使用結(jié)合珠子清理cDNA,。試劑盒中還包括一個陰性對照非免疫IgG,，可以用來展示試劑盒的效果，并在富集RNA定量或生物分析儀分析步驟中展示性能,。

EpiNext™CUT&RUN-RNA m6A-Seq試劑盒的工作流程,。