在三十億年的進(jìn)化過程中，大自然通過重復(fù)的隨機(jī)突變和體內(nèi)選擇編碼蛋白的*功能,，產(chǎn)生了大量蛋白質(zhì),。這種自然進(jìn)化的例子啟發(fā)了研究人員在過去二十年中開發(fā)了體外排列蛋白的策略。

在應(yīng)用的各種策略中,，出現(xiàn)了三種主要的強(qiáng)大技術(shù),。

通過dNTP類似物的隨機(jī)突變

這種方法基于將突變性dNTP類似物，如8-0xo-dGTP和dPTP,，通過PCR并入擴(kuò)增的DNA片段,。在僅存在四種天然dNTP的情況下進(jìn)行第二步驟PCR，淘汰突變性dNTP,，實現(xiàn)高達(dá)20%的突變率,。

1.JBS dNTP突變試劑盒 #PP-101

通過錯誤傾向PCR的隨機(jī)突變

由Caldwell和Joyce（1992）開發(fā)，這種方法使用在引起DNA聚合酶錯誤率增加的條件下的PCR反應(yīng),，在感興趣的基因中引入突變,。通過錯誤傾向PCR實現(xiàn)的突變率在0.6-2.0%范圍內(nèi)。

2.JBSError傾向試劑盒IPP-102

通過DNA Shuffling的隨機(jī)突變

由Stemmer（1994）開發(fā),，DNA Shuffling通過隨機(jī)切割一個基因或一組相關(guān)基因,，然后通過自引物PCR反應(yīng)重新組裝片段來生成庫。這種方法允許來自不同相關(guān)基因的序列重組,。整體突變率大約為0.7%,。

3.艾美捷DNA Shuffling試劑盒 #PP-103

Jena Bioscience現(xiàn)在為每種技術(shù)的“即用型"提供所有必要的組件，單獨(dú)的試劑盒,，并附有簡化的文檔,，以Z大化成功。

一般實驗室用途,。

運(yùn)輸：在凝膠包上運(yùn)輸

儲存條件：存儲在-20℃

附加儲存條件：避免凍融循環(huán)

保質(zhì)期：12個月

通過DNA Shuffling的隨機(jī)突變

DNA Shuffling是一種在體外有目標(biāo)地進(jìn)化蛋白質(zhì)的強(qiáng)大技術(shù),。它通過來自一個或幾個相關(guān)基因的基因片段的重組生成結(jié)構(gòu)多樣性。DNA Shuffling可以分為單基因 Shuffling和多基因 Shuffling（圖1）。在單基因 Shuffling中,，只有一個基因被消化,，然后重新組裝，導(dǎo)致點突變的比率大約為0.7%,。DNA Shuffling在蛋白質(zhì)進(jìn)化中的主要應(yīng)用是多基因 Shuffling（通常稱為分子育種）,。在這項技術(shù)中，幾個同源DNA序列被消化,，然后重新組裝,。結(jié)果是包含額外點突變的嵌合基因庫。

DNA Shuffling中的關(guān)鍵步驟是對感興趣的基因進(jìn)行消化,，以產(chǎn)生合適大小的片段,。因此，試劑盒中的所有試劑都經(jīng)過優(yōu)化,，以便在方便的時間框架內(nèi)獲得所需大小的片段（圖2）,。通常，使用平均大小為70-280 bp的片段會取得最佳結(jié)果,。請注意,，wan全的DNase I消化會產(chǎn)生非常短的片段，這些片段無法通過隨后的PCR進(jìn)行擴(kuò)增,。

圖1：DNA混洗的一般類型

圖2:1000bp DNA片段的DNA酶I消化與孵育時間的函數(shù)關(guān)系（37℃下1μg DNA+0.1單位DNA酶I）

DNA Shuffling試劑盒參考文獻(xiàn)：

Crameri et al. (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse speciesaccelerates directed evolution. Nature 391:288.

Patten et al. (1997) Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals andvaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 8:724.

Stemmer (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly. Invitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:10747.

Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature370:389.