膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織中含量zui豐富的不溶性蛋白質(zhì),。它可以在皮膚,，肌腱，骨,、軟骨,、肌肉、玻璃體和韌帶等組織,。有超過(guò)16種特征鮮明的類型膠原蛋白,，但I型,、II型和III型膠原蛋白在哺乳動(dòng)物中的含量超過(guò)80%,。膠原的三重螺旋結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜*之處：它由一個(gè)基本三聚體的重復(fù)模式組成：甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸。

在細(xì)胞中，膠原蛋白以前膠原的形式分泌這些鏈被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng),，在那里,，大量的翻譯后修飾導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成具有二硫鍵的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的過(guò)度產(chǎn)生與病理狀況有關(guān),，包括肝硬化,、肺結(jié)核和肺結(jié)核纖維化和腫瘤生長(zhǎng)。BioVision的膠原蛋白檢測(cè)試劑盒是一種簡(jiǎn)單,、靈敏的檢測(cè)多種蛋白質(zhì)中少量膠原蛋白的檢測(cè)試劑盒樣品的數(shù)量,。該分析基于樣品酸水解形成水解物和羥脯氨酸。這釋放了羥脯氨酸氧化形成反應(yīng)中間體,，在反應(yīng)中進(jìn)一步形成發(fā)色團(tuán)（Abs 560 nm）,。

那么，如何選擇快速方便的膠原蛋白檢測(cè)試劑盒試劑盒呢,？接下來(lái)小艾要介紹的這款膠原蛋白檢測(cè)試劑盒 檢測(cè)方法簡(jiǎn)單,，對(duì)膠原蛋白敏感且特異，可在各種樣本（如組織勻漿）中檢測(cè)到低至0.5µg的膠原蛋白,，生物液體和純化蛋白質(zhì),。

艾美捷 膠原蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方案：

1、樣品制備：組織或蛋白質(zhì)/肽樣品：組織樣品（即肺）應(yīng)在ddH2O中均勻化,，使用100µl

每10 mg組織使用ddH2O,。向100µl樣品勻漿中添加100µl濃HCl（~12 M，未提供）,，并將其放入一個(gè)壓力合適的聚丙烯螺旋蓋小瓶中,。在120°C下水解樣品3小時(shí)（見注釋C）。尿液：用等量水水解樣品壓力密封聚丙烯螺旋蓋小瓶中12m濃HCl（即100µl尿液+100µl HCl）的體積,。之后均質(zhì),，通過(guò)添加4 mg活性炭，用活性炭澄清樣品,。以10000 x g的速度旋轉(zhuǎn)并離心3小時(shí)至少清除沉淀和活性炭,。如果需要，重復(fù)上述步驟,。將2-30µl各水解樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中,，并通過(guò)在熱板/干熱塊或微孔板培養(yǎng)箱上70°C加熱板蒸發(fā)至干燥。

2,、標(biāo)準(zhǔn)品制備：將25µl膠原蛋白I標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶螺絲帽的壓力密封聚丙烯小瓶中,，并添加25µl膠原蛋白12 M濃鹽酸（未提供）。牢固擰緊蓋并在120°C下水解3小時(shí),。在冰上冷卻小瓶,，然后旋轉(zhuǎn)小瓶?jī)?nèi)容物（zui終體積為50µl,，zui終濃度為1 mg/ml水解膠原蛋白）。添加0,、2,、4、6,、8和10µl的1mg/ml水解I型膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液放入96孔板中的一系列孔中,，生成0、2,、4,、6、8和10的當(dāng)量µg膠原蛋白/孔,。通過(guò)在熱板/干熱塊上70°C加熱板,，將標(biāo)準(zhǔn)曲線井蒸發(fā)至干燥，或微孔板培養(yǎng)箱,。注：為防止微孔板塑料翹曲/蝕刻,，請(qǐng)勿將微孔板暴露在J端溫度（>85°C）下。如果天氣炎熱使用平板/烤箱時(shí),，我們建議將微孔板放置在70°C下,，直到內(nèi)容物*蒸發(fā)

3、反應(yīng)：向每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中添加100µl氯胺T試劑,，并在室溫下培養(yǎng)10分鐘,。添加向每個(gè)孔中加入100µl DMAB試劑，并在60°C下培養(yǎng)90分鐘,。

4,、測(cè)量：將板從熱源上取下，并在560處測(cè)量所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的吸光度端點(diǎn)模式下的nm（OD560）,。對(duì)于zui大信號(hào)強(qiáng)度,，在將板從加熱爐中取出后20分鐘內(nèi)測(cè)量吸光度

5、計(jì)算：對(duì)于膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,，從所有標(biāo)準(zhǔn)中減去零標(biāo)準(zhǔn)（0μg/孔試劑空白）讀數(shù)

,，繪制背景減去值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。對(duì)于測(cè)試樣品,，減去零從樣品讀數(shù)中讀取標(biāo)準(zhǔn)（0μg/孔試劑空白）,，并將背景減去的OD560值應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線，以在井中獲得Bμg膠原蛋白,。