膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分之一,，膠原水平的過高或過低都會(huì)導(dǎo)致疾病,。例如：膠原過多會(huì)導(dǎo)致組織纖維化，過少會(huì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎,。因此在許多疾病研究中檢測(cè)膠原水平非常重要,。

艾美捷 Biovision總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒（比色法）基于樣品中膠原蛋白酸水解產(chǎn)生水解產(chǎn)物和羥脯氨酸，羥脯氨酸被進(jìn)一步氧化代謝產(chǎn)生有色產(chǎn)物,，于560 nm處有吸收峰.

該膠原蛋白檢測(cè)試劑盒組分：

1,、96孔平底透明板

2、多阱分光光度計(jì)

3,、12 M鹽酸（濃鹽酸）

4,、水解：聚丙烯小瓶（BV類別號(hào)M1352）和螺帽

艾美捷 Biovision膠原蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方案：

1.樣品制備：組織或蛋白質(zhì)/肽樣品：組織樣品（即肺）應(yīng)在ddH2O中均勻化，使用100µl每10 mg組織使用ddH2O,。向100µl樣品勻漿中添加100µl濃HCl（~12 M,，未提供），并將其放入一個(gè)壓力合適的聚丙烯螺旋小瓶中,。在120°C下水解樣品3小時(shí)（見注釋C）,。尿液：用等量水水解樣品壓力密封聚丙烯螺旋蓋小瓶中12m濃HCl（即100µl尿液+100µl HCl）的體積。之后均質(zhì)，通過添加4 mg活性炭,，用活性炭澄清樣品,。以10000 x g的速度旋轉(zhuǎn)并離心3小時(shí)至少清除沉淀和活性炭。如果需要,，重復(fù)上述步驟,。將2-30µl各水解樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中，并通過在熱板/干熱塊或微孔板培養(yǎng)箱上70°C加熱板蒸發(fā)至干燥,。

注意：

A.對(duì)于未知樣品,，建議進(jìn)行初步試驗(yàn)，以確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),，并且相應(yīng)地調(diào)整樣品水解液的體積（可使用2-30µl水解液）或在必要時(shí)稀釋水解液,。

B對(duì)于膠原蛋白濃度J低的樣品，建議平行運(yùn)行兩個(gè)測(cè)試樣品井,，并加一個(gè)使用已知量的I型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（4.0µg）,，以確保準(zhǔn)確測(cè)定。

C對(duì)于樣品水解,，帶有緊配合螺旋蓋（無O形圈）的聚丙烯小瓶產(chǎn)生好結(jié)果,。推薦Biovision的聚丙烯瓶和蓋（類別號(hào)M1353和M1352）。

圖：（a）水解膠原蛋白I標(biāo)準(zhǔn)曲線（0-10µg）,。（b） 大鼠組織中總膠原濃度的估算,。鼠腎，肝,、肺和肌肉樣品用ddH2O均質(zhì),，并在120°C下用12 M HCl水解3小時(shí)。沉淀被分離通過離心（10000 x g,，持續(xù)3分鐘）去除,。根據(jù)試劑盒測(cè)定30微升水解樣品協(xié)議。膠原含量（mg膠原/g濕組織）：腎臟：2.01±0.22,；肝臟：0.71±0.32,；肺：3.03±0.3；肌肉：3.25±0.98,。