前言：熒光定量PCR是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的,。經(jīng)過二十年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷各種傳染病診斷和療效評價；臨床疾病診斷動物疾病檢測,；食源微生物,、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因研究等食品安全操作等等各個領(lǐng)域,。

1,、基因分型

例如SNP檢測，甲基化檢測等,。

SNP檢測是確定一對染色體的每種基因的兩個拷貝,，哪種點突變在這兩個拷貝中存在，因此利用熒光定量PCR方法,，并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測到SNP結(jié)果,。

DNA甲基化是Z早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?span style="font-family: Calibri;">5’-甲基胞嘧啶,。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá),。

2,、基因表達(dá)差異分析

例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理,、化學(xué)處理等 ),，特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證 。

基因表達(dá)差異通常是指一個基因在兩個條件中表達(dá)水平的檢測值在排除實驗,、檢測等因素外,，達(dá)到一定的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義,，同時也具有生物學(xué)意義,。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測,，RNAi基因失活率的檢測等,。基因失活是指利用反義技術(shù),，使非正常基因或有害基因不表達(dá)或降低表達(dá)活性,，以達(dá)到治療某些特定疾病的目的,。

實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。

實時熒光定量PCR系統(tǒng)知識匯總

1.在qPCR 技術(shù)中重要的參數(shù)指標(biāo)有哪些,？

擴(kuò)增及溶解曲線：擴(kuò)增曲線是PCR過程中,，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進(jìn)程,；溶解曲線是用來驗證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的,，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰,，如果有引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增,，就會出現(xiàn)至少兩個峰。

熒光域值（threshold）: 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值,，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold,。

Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線,。Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在線性關(guān)系,，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值,，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,，就可以求出未知樣品的起始模板量。

2.擴(kuò)增曲線一般分為哪幾個階段

熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期,、指數(shù)增長期和平臺期,。在qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化,，此時即為基線期，

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,，zui終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入平臺期,，在該時期,，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,，只有在熒光信號的指數(shù)增長期,，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析,。

3.ROX染料是什么作用,？

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應(yīng)中能被qPCR儀檢測到,。ROX不參與qPCR反應(yīng),，熒光信號值不會隨著qPCR擴(kuò)增而改變,。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學(xué)因素（液滴,、氣泡）的因素,，反應(yīng)體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進(jìn)行歸一化校正,，以提高數(shù)據(jù)的較精確度,。

4.Ct值多少才算理想

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴(kuò)增,，但也不是的,，需要輔以溶解曲線加以解釋。

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