如果SARS-CoV-2的大流行對我們有任何啟發(fā)的話，那么要數(shù)對RNA修飾的研究了,，此時(shí)研究病毒RNA以及其甲基化修飾等功能,，顯得比以往任何時(shí)候都更加重要。 而這是否意味著要研究病毒RNA本身不同的各種突變體或者表觀遺傳變化如何使這些病毒更靈活和感染力,？還是研究從細(xì)胞和組織中收集的RNA是怎么對宿主細(xì)胞功能的產(chǎn)生影響和致病的,？然后，現(xiàn)實(shí)告訴我們,，這項(xiàng)研究工作幾乎是無止境的,。

通常，設(shè)置實(shí)驗(yàn)中*具挑戰(zhàn)性的部分之一是每一步實(shí)驗(yàn)操作的處理方式,。 

首先我們了解一下研究背景：

m6A RNA甲基化和去甲基化循環(huán)

m6A RNA的形成是由多蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物調(diào)控的,，部分由METTL酶調(diào)控。近的研究發(fā)現(xiàn),，在哺乳動(dòng)物中存在這些甲基化酶“寫入者”及其相關(guān)的去甲基酶“擦除者”,，揭示出 RNA m6A甲基化修飾是可逆的，如下圖所示,。 一個(gè)甲基通過METTL3 / 14異二聚體以化學(xué)方法加入到腺苷（A）殘基的氮6位上,，形成了N6-甲基腺苷（m6A）。 然后,，m6A可以通過FTO介導(dǎo)的氧化脫甲基作用,，逐步轉(zhuǎn)化為N6-羥甲基腺苷（hm6A），隨后轉(zhuǎn)化為N6-甲酰腺苷（f6A）,，后終還原為原始腺苷酸（A）,。

m6A修飾對RNA病毒生命周期的影響

 已知表觀遺傳修飾會(huì)影響人類冠狀病毒等RNA病毒的生命周期。據(jù)報(bào)道,，像N6-甲基腺苷（m6A）這樣的腺苷甲基化修飾可通過調(diào)節(jié)病毒帽結(jié)構(gòu),，病毒基因表達(dá)，病毒傳代,，先天傳感途徑和先天免疫應(yīng)答來影響某些RNA病毒的生存能力,。 m6A的獲得或喪失可導(dǎo)致RNA病毒發(fā)生重大功能變化,，從而改變其宿主細(xì)胞的融合/進(jìn)入，復(fù)制,，傳播,，致病強(qiáng)度和免疫逃逸。宿主細(xì)胞的m6A轉(zhuǎn)錄組在宿主抵抗性能中起作用,，在病毒感染后也可能因此而發(fā)生改變,。

SARS-CoV-2基因組的長度超過29,800個(gè)核苷酸，包含50多個(gè)潛在的m6A位點(diǎn),，這些甲基化位點(diǎn)的堿基是RNA甲基化酶復(fù)合體METTL3 / 14修飾的m6A特定堿基,，包括GGACU（T），GGACA ,，以及GGACC,。因此,，SARS-CoV-2 RNA中所有腺苷中有大于 0.64％,，或大于0.18％的所有堿基都可能是m6A修飾的。因此,，總RNA中的m6A定量和整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的m6A定位對于研究與m6A相關(guān)的病毒功能和相應(yīng)的機(jī)制以及確定抗病毒治療的新靶標(biāo)至關(guān)重要,。

那么，病毒RNA修飾的研究工作流程有哪些呢,？

首先,，提取病毒RNA

無論您是從細(xì)胞，組織還是病毒等樣品開始實(shí)驗(yàn),，高效而快速的RNA提取通常都是成功進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的第1步,。工作流程的這一部分至關(guān)重要，因?yàn)樽銐虻募兌群彤a(chǎn)量都是確保下游應(yīng)用程序平穩(wěn)準(zhǔn)確運(yùn)行的基本要求,。

而同時(shí),，在選擇試劑盒的時(shí)候，要注意的是,， 我們需要根據(jù)樣本類型來挑選：

1）病毒樣本：對于病毒樣品,，諸如低病毒滴度和高污染宿主核酸的存在等挑戰(zhàn)要求使用補(bǔ)充技術(shù)來確保產(chǎn)量和純度符合下游實(shí)驗(yàn)的要求。在我們近的公告文章中,，我們概述了完成此操作的10種方法,，因此您可以將其應(yīng)用到適合您的學(xué)習(xí)的方法中。實(shí)現(xiàn)病毒擴(kuò)增的常用方法是：接種病毒至宿主細(xì)胞,，擴(kuò)大培養(yǎng)宿主細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增,，然后收集擴(kuò)增的病毒體，搭配EpiGentek病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA,。注意：對于直接從臨床標(biāo)本中提取的病毒RNA,，在m6A RNA富集之前,，需要去除宿主DNA和rRNA污染物。

2）細(xì)胞/組織樣本：不需要特別處理,；由于可以從細(xì)胞和組織樣品中獲取大量豐富的RNA,，因此不需要太多額外的處理就可以獲得足夠下游應(yīng)用的RNA樣本。建議使用EpiGentek總RNA快速提取試劑盒或EpiQuik 磁珠法快速RNA提取試劑盒,。

病毒RAN快速提取試劑盒總RNA提取試劑盒（P-9107）

總RNA 快速提取試劑盒（P-9105）

細(xì)胞核提取試劑盒

當(dāng)處理細(xì)胞或組織樣本時(shí),，核提取的階段很重要。而核提取物將終進(jìn)

行甲基酶或脫甲基酶活性/抑制作用的分析,。 在這一步驟中,，核蛋白提取試劑盒（OP-0002-1 ）可以用預(yù)裂解和裂解緩沖液處理細(xì)胞/組織，分別破壞細(xì)胞膜和核膜,，

并提取核蛋白以用于下游實(shí)驗(yàn),。

可1小時(shí)的快速提取核蛋白，并可以保持完整的酶活性,。

RNA甲基化是一種可逆的翻譯后修飾,，它在表觀遺傳上影響許多生物學(xué)過第二步，定量m6A/5mC RNA是*的：

這些過程可能同時(shí)發(fā)生在病毒和非病毒來源的RNA中,。其中常見的是m6A甲基化,，占所有RNA甲基化的80％以上，其次是5-mC甲基化,，這可能發(fā)生在各種RNA分子中,。

M6A RNA甲基化定量檢測試劑盒（比色法）（P-9005-48）

隨后, 需要檢測m6A甲基化酶和脫甲基酶活性

如果是想研究RNA甲基化酶或去甲基化酶的活性/抑制作用，建議使用上述提到的功能強(qiáng)大的核提取試劑盒（OP-0002）,，該試劑盒可以快速提取核蛋白,，同時(shí)可確保提取后的酶活性保持完整。

收集了核提取物后,，進(jìn)行甲基化酶或脫甲基酶活性/抑制作用的測定,，基于ELISA法的去甲基化或者甲基化酶活性檢測試劑盒（P-9019），該試劑盒可以對樣品進(jìn)行高通量分析,，并經(jīng)過優(yōu)化以保證較低的信噪比,，測量準(zhǔn)確可靠。

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