1.PCR的概念

PCR,，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,，PCR），主要由高溫變性,、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,，在DNA聚合酶和適宜的溫度下,，兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）為底物,，使退火引物得以延伸,，如此反復(fù)，使位于兩段已知序列之間的DNA丨片段呈幾何倍數(shù)擴增,。

 2.PCR的分類

PCR有很多種,，核心就是用引物擴增特定的DNA，以指數(shù)方式倍增的DNA達到可以觀察到的量后,，通過不同的觀察方法比較DNA相對表達的高低,。根據(jù)檢測方式的不同，分為終點 PCR（也即常規(guī)PCR）和實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,，qPCR）,根據(jù)樣本類型的不同,，還包括以RNA為模板的反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）,。

終點PCR

終點PCR,，顧名思義既是對PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定性及定量分析，在反應(yīng)過程中無法監(jiān)測反應(yīng)進行情況,，只有反應(yīng)完成后通過跑膠得到結(jié)果,。

DNA聚合酶，貨號：01-02-00500

高保真PCR,，貨號：04-25-00115

多重PCR，貨號：04-36-00120

高GC含量模板PCR預(yù)混液,，貨號：04-33-00115

長片段PCR試劑盒,，貨號：PC002

1.熱啟動PCR（hot start PCR）

在傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中，反應(yīng)體系各成分（Taq DNA聚合酶,、dNTP 和引物等）均是一次加入并進入循環(huán),，在反應(yīng)溫度由室溫（25℃）上升至高溫（94～95℃）過程中，可能發(fā)生引物錯配和二聚體的形成,。引物與模板中一些非靶位點的錯配和引物之間形成的二聚體,，在Taq酶的作用下均可延伸，這些非特異性產(chǎn)物又可以在后面的PCR循環(huán)中繼續(xù)擴增,，使非特異性產(chǎn)物不斷積累,，同時，也消耗反應(yīng)體系的各成分,，終PCR擴增的特異性產(chǎn)物大大減少,。熱啟動PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時才發(fā)揮作用的PCR。通過這種方式控制PCR反應(yīng)的必須組分DNA聚合酶,，直到反應(yīng)混合物被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚合的溫度后,，再啟動PCR達到有效擴增特異性PCR產(chǎn)物的目的,。

*UNG酶通常和熱啟Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染體系的熱啟動PCR反應(yīng)系統(tǒng)。

UNG酶(Uracil-N-glycosylase,，尿嘧啶-N-糖基化酶)的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵,，形成的有缺失堿基的DNA鏈在堿性介質(zhì)以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除,。UNG酶的丨佳活性溫度為50℃,，95℃滅活。作用：為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性,，要預(yù)防非特異性PCR擴增和污染,。常用的措施是使用UNG酶（Uracil-N-Glycosylase）和Taq 酶熱啟動。PCR反應(yīng)常見,，重要的污染物是PCR產(chǎn)物,，防污染熱啟動PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈,。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟,，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂,，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴增,，從而保證擴增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性,。

2.高保真PCR

Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性,，缺少3'→5'的外切酶活性，但沒有從3'→5'方向外切酶的活性,，擴增得到的PCR產(chǎn)物的3'末端附有一個“A”堿基,，可直接用于TA克隆，但是由于不具有3'→5'外切酶活性,，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能,。DNA聚合酶的校正能力決定了保真度，會影響DNA序列復(fù)制的準(zhǔn)確性,。Solis Biodyne提供的blend mix同時包含Taq酶和校正酶,，使得PCR反應(yīng)既具有5'→3'方向合成DNA的功能，又具有3'→5'方向外切酶的活性和糾錯功能,。

3.多重PCR

多重PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物,，同時擴增出多個核酸片段的 PCR反應(yīng)。多重PCR不僅意味著節(jié)省時間,、試劑和樣品,，還能夠同時對比多個擴增子。

在多重PCR中,，因無法僅針對一個引物對或目的片段進行反應(yīng)優(yōu)化,，而是要考慮到所有引物和靶標(biāo),，所以可能會出現(xiàn)非特異性擴增和效率降低。因此,，為盡量減少由非特異性擴增導(dǎo)致的錯配,，應(yīng)對引物進行精心設(shè)計。首先,，引物序列應(yīng)盡可能與其目的序列一一對應(yīng),，并且所有引物的 Tm相差不應(yīng)超過5°C。其次,，在多重PCR開始前,，應(yīng)利用單個PCR反應(yīng)驗證每個引物對的特異性和擴增效率。此外,，擴增子應(yīng)具有不同的大小,，從而能夠通過凝膠電泳對其進行分離鑒定。

4.長片段PCR

常規(guī)PCR反應(yīng)可以擴增到3~4kb的DNA丨片段,，而超過5kb的DNA丨片段就已經(jīng)很難擴增出來了,。長片段PCR即是指擴增大于5kb的DNA丨片段。NCBI推薦的基因克隆供應(yīng)商GeneCopoeia可提供長片段PCR試劑盒,，可擴增18kb人來源gDNA以及30kb λ噬菌體DNA為模板等大片段DNA,，同時可擴增高GC%片段，適用范圍廣,，實驗過程中僅需添加引物與模板,，操作簡便。

5.高GC含量PCR

在DNA（A,、T,、C、G）4種堿基中,，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率稱為GC含量,。因為G,、C之間形成三對氫鍵,，解鏈所需能量較高，所以模板很難打開,，高GC含量（G+C≥60%）模板擴增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)妨礙DNA聚合酶在模板上的推進,，而且模板上可能存在多個非特異性的引物復(fù)性位點，導(dǎo)致非特異性擴增,，甚至很多時候擴增不出靶基因,。Solis BioDyne可專業(yè)提供專業(yè)的高GC含量模板的PCR增強劑和預(yù)混液，可適用于GC含量高至79%的模板,，輕松解決高GC含量PCR的難題,。

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