上期談到了“蛋白質(zhì)濃度測(cè)定常用的三種方法”,，今天繼續(xù)就這話題詳解另一種蛋白定量的方法--Bradford 法，至于選用哪種方法,，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件和個(gè)人喜好來(lái)選,！做實(shí)驗(yàn)前我們先了解一下實(shí)驗(yàn)原理，如下：

BCA法實(shí)驗(yàn)原理：堿性條件下,，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+結(jié)合生成紫色絡(luò)合物,，同時(shí)將Cu2+還原為Cu+。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結(jié)合,，形成穩(wěn)定的有顏色的絡(luò)合物,，562nm處有高的吸收值，可在540-595nm測(cè)定其吸收值,，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度,。

Bradford 法實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮藍(lán)G250,在游離狀態(tài)下呈紅色,，大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有大光吸收,。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡,，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定,。該法試劑配制簡(jiǎn)單,，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏,，靈敏度比Lowry法還高4倍,，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。

快速測(cè)蛋白法

要想加快速度好是選用 Bradford 法了,，這是為什么呢,？看Abbkine蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）優(yōu)點(diǎn)就知道了：

" 節(jié)省時(shí)間—顯色反應(yīng)迅速

" 兼容性好—不受大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的影響。對(duì)于樣品中巰基乙醇和二硫蘇糖醇的兼容濃度,，分別可達(dá)1mM和5mM,。

" 良好的檢測(cè)范圍—檢測(cè)范圍為50 - 1000ug/ml。

下圖就是用 Bradford 法測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。雖然線性擬合不佳,，但是二項(xiàng)式吻合度卻非常高，可以說(shuō)非常了,。

下圖展示了如何在 excel 中制作二項(xiàng)式標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

到此為止,，前面我們擔(dān)心的幾個(gè)問(wèn)題就已經(jīng)全部解決了。,，擔(dān)心 Triton 或 SDS 的影響,，我們用去垢劑兼容性的 Bradford 試劑即可,。第二,，擔(dān)心標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳，我們用二項(xiàng)式來(lái)擬合即可,。

下面我們繼續(xù)利用 excel 的自動(dòng)化功能進(jìn)一步提升計(jì)算速度,。首先，初中的時(shí)候大家就學(xué)過(guò),，解二項(xiàng)式的公式是：

這條曲線是一條開(kāi)口向下的拋物線,，所以取 x 軸上的較小的值就是我們所要的濃度值。為了簡(jiǎn)單易用,，我們可以先命名幾個(gè)單元格為 background,，a，b,，c,，從酶標(biāo)儀讀取 OD 值之后填入 background，復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)曲線的光密度值,，填入 excel 給出的方程中的 a,，b，c 之后,，excel 就能自動(dòng)減去背景計(jì)算出濃度了,。

整個(gè)過(guò)程熟練的話 1 分鐘足矣，操作的同學(xué) 2 分鐘也就足夠了,。俗話說(shuō)好馬配好鞍,，快速 WB 需得配合快速蛋白定量方能有一氣呵成、唯快不破的痛快淋漓,。但是,，使用這種方法需要注意的幾個(gè)問(wèn)題：

注意要點(diǎn)

1. 蛋白濃度不能太高，如果超過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍（比如 OD>2）,，那就測(cè)量不準(zhǔn)了,。不僅是本方法，所有基于濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法都是如此,，比如 ELISA,。當(dāng)然也不能太低了。

2. 大約 10 年前就有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)量雙波長(zhǎng),，即 A595 和 A450 的比值能夠獲得良好的線性關(guān)系并提高靈敏度,，這種方法我試過(guò)了,，在 0.125-1.5 mg/ml 的范圍內(nèi)準(zhǔn)確性不如二項(xiàng)式曲線擬合高。

3. 另外,，標(biāo)準(zhǔn)品有可能發(fā)生降解導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)確,，建議每次測(cè)量時(shí)加入一個(gè)已知濃度的樣本作為校驗(yàn)。我每次都會(huì)加入一個(gè) 0.1-0.5 mg/ml 的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品,，校驗(yàn)一下曲線是否準(zhǔn)確,。

4.加入標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候槍頭一定不能有殘留，否則容易引起較大誤差,，建議初學(xué)者剛開(kāi)始時(shí)做 2 到 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)孔,。

5.Bradford 法加完樣之后需立刻馬上測(cè)量，OD 值能穩(wěn)定保持 10 分鐘左右,，如果不能馬上測(cè)量,，建議換用 BCA 法。

6. 大招：如果你已經(jīng)是老司機(jī)了,，還有個(gè)方法不用測(cè)蛋白濃度,，只要在顯微鏡下估測(cè)各組細(xì)胞密度差不多，直接提蛋白變性上樣跑 WB 即可,。但老司機(jī)也有翻車(chē)的時(shí)候,，請(qǐng)慎用。