A3/KAW細(xì)胞，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異,，有時因寄贈、交換和購買,，培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個實驗室,，策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點(diǎn),。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止,，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,，在于通過0~20℃階段的處理過程,。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀,，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷,。

一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失,，最小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化,，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前,，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染,。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下:

包含10%甘油的*培養(yǎng)基,，

包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基,，

50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基,。

對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:

50% 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,，或

包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基,。

A3/KAW細(xì)胞，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤

1,、懸浮細(xì)胞

計數(shù)將要凍存的活細(xì)胞,。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,，使用移液管移去上清到最小體積,，不要攪亂細(xì)胞。

以1×10⁷到5×10⁷細(xì)胞/ml密度,，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞,，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞,。

分裝進(jìn)凍存管,，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

2,、貼壁細(xì)胞

使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時盡可能溫和,，使對細(xì)胞的損傷減少到最小,。

在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞,，確定有活力細(xì)胞數(shù),。

以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到最小體積,，不要攪亂細(xì)胞,。

以5×10⁶到1×10⁶細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞,。

分裝進(jìn)凍存管,，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

二,、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱,，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化,，并直接加入*生長培養(yǎng)基中,。若細(xì)胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長培養(yǎng)基中,。

1、直接鋪板方法

取出貯存細(xì)胞,，37℃水浴中快速融化,。

直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基,。進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù),，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細(xì)胞/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時,，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基,，去除凍存劑。

2,、離心方法

取出貯存細(xì)胞,，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基,，輕輕混勻,。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清,。

在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞,，并且進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。

細(xì)胞鋪板,，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml,。

三、細(xì)胞的分化,、衰老與死亡

1,、細(xì)胞的分化:一個成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞:形態(tài)結(jié)構(gòu),，代謝,，行為，功能等各不相同,。追根溯源,，這么多種細(xì)胞均來自一個受精卵細(xì)胞,。所以，通常把發(fā)育過程中,，細(xì)胞后代在形態(tài),、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段,，也發(fā)生在胎兒出生以后,，乃至成人階段。例如,，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個過程在人的一生中一直持續(xù)著,。

由旺盛生長不斷分裂的細(xì)胞,，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時一個確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期,。旺盛生長分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞,，它們的基因表達(dá)和代謝活動各不相同。

2,、細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗證明:

成纖維細(xì)胞:來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡,。

細(xì)胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括:蛋白質(zhì)合成速度降低,，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn);同時，細(xì)胞核,，線粒體,，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu),、功能的改變,。

細(xì)胞衰老原因，尚無定論,，出現(xiàn)過好幾種理論與假說,，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說”。

3,、細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種:壞死,、凋亡和細(xì)胞毒性,。多細(xì)胞生物的生命活動中，因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵,，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死亡,，稱為細(xì)胞的病理死亡,，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時導(dǎo)致的細(xì)胞死亡;細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件,，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理,，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。