639-V細胞,，移行細胞癌

細胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈,、交換和購買,，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，策略是進行低溫保存,。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,，細胞內(nèi)的酶活性均己停止,，即代謝處于*停止狀態(tài)，故可以長期保存,。細胞低溫保存的關(guān)鍵,，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi),，水晶呈針狀,，極易招致細胞的嚴重損傷。

一,、細胞的凍存:為避免污染造成的損失,，最小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細胞,。凍存細胞前,，細胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞,。對于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下:

包含10%甘油的*培養(yǎng)基，

包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基,，

50% 細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基,，或

50% 細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對于無血清培養(yǎng)基,，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:

50% 細胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,，或

包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。

639-V細胞，移行細胞癌

1,、懸浮細胞

計數(shù)將要凍存的活細胞,。細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細胞,，使用移液管移去上清到最小體積,，不要攪亂細胞。

以1×10⁷到5×10⁷細胞/ml密度,，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞,，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細胞,。

分裝進凍存管,，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

2,、貼壁細胞

使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和,，使對細胞的損傷減少到最小,。

在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞,，確定有活力細胞數(shù)。

以大約200g離心5分鐘沉淀細胞,。使用移液管移去上清到最小體積,，不要攪亂細胞。

以5×10⁶到1×10⁶細胞/ml密度,，在凍存液中懸浮細胞,。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

二、凍存細胞的復(fù)蘇:凍存細胞較脆弱,，要輕柔操作,。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養(yǎng)基中,。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長培養(yǎng)基中。

1,、直接鋪板方法

取出貯存細胞,，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細胞,。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基,。進行活細胞計數(shù)，細胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細胞/ml,。培養(yǎng)細胞12到24小時,，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑,。

2,、離心方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化,。

把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基,，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘,。

棄去上清,。

在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數(shù),。

細胞鋪板,，細胞接種應(yīng)該至少為3×105活細胞/ml。

三,、細胞的分化,、衰老與死亡

1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數(shù)約1012個,，可以區(qū)分為200多種不同類型的細胞:形態(tài)結(jié)構(gòu),，代謝，行為,，功能等各不相同,。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞,。所以,，通常把發(fā)育過程中，細胞后代在形態(tài),、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細胞分化,。細胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段,。例如,，人體血細胞的產(chǎn)生和分化，這個過程在人的一生中一直持續(xù)著,。

由旺盛生長不斷分裂的細胞,，轉(zhuǎn)入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期,。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞,，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2,、細胞的衰老:體外細胞培養(yǎng)實驗證明:

成纖維細胞:來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡,。

細胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括:蛋白質(zhì)合成速度降低,，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn);同時，細胞核,，線粒體,，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu),、功能的改變,。

細胞衰老原因，尚無定論,，出現(xiàn)過好幾種理論與假說,，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3,、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細胞死亡形式有3種:壞死,、凋亡和細胞毒性,。多細胞生物的生命活動中,，因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵,，導(dǎo)致一部分細胞死亡，稱為細胞的病理死亡,，或細胞壞死,。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學(xué)刺激時導(dǎo)致的細胞死亡;細胞毒性是由細胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理,，如殺傷T細胞的細胞毒性作用,。