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懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟及優(yōu)化注意事項

閱讀:1781        發(fā)布時間:2023/4/11
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  懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞生長不依賴支持物表面,,在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長,,如淋巴細(xì)胞。在實驗室經(jīng)常會遇到懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,,其和貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染有很大的不同,。
  懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染通常可能遇到:
  1.效率明顯低于貼壁細(xì)胞,。
  2.細(xì)胞不易培養(yǎng),,死亡率高。
  3.轉(zhuǎn)染試劑毒性大,,細(xì)胞死亡加劇這三種問題,,為了提高懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,可以使用毒性較小的非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑,,也可以使用電轉(zhuǎn)染方法,,提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,電擊對細(xì)胞有一定的損傷,,最好選用具有細(xì)胞膜修復(fù)功能的電轉(zhuǎn)染試劑,,可以將電擊對細(xì)胞的傷害降到。
  轉(zhuǎn)染過程中,,操作步驟一定要謹(jǐn)慎,。
  以24孔板siRNA轉(zhuǎn)染為例
  1.提前1天細(xì)胞種植
  懸浮細(xì)胞:采用對數(shù)生長期的細(xì)胞,數(shù)量為常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的1/3進行轉(zhuǎn)染實驗,。如某細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)是6×10^5,,那么就用2×10^5的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。
  2.轉(zhuǎn)染過程
 ?、湃?.67μg(50pmol)的siRNA,,加入一定量無血清稀釋液,充分混勻,,制成RNA稀釋液,,終體積為25μl。
  注意:無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM,、無血清DMEM或1640,。
  ⑵取1μl的Entranster-R4000,,然后加入24μl無血清稀釋液體,,充分混勻,制成Entranster-R4000稀釋液,,終體積為25μl,。室溫靜置5分鐘。
  ⑶將Entranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合(可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上)混合,,室溫靜置15分鐘,。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。
 ?、葘?0μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45ml全培養(yǎng)基(可含10%血清和抗生素)的細(xì)胞上,,前后移動培養(yǎng)皿,混合均勻,。
  注意:對本試劑,,采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。
 ?、赊D(zhuǎn)染后6小時觀察細(xì)胞狀態(tài),,如狀態(tài)良好可不必更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時得到結(jié)果,。
  注意:1.siRNA轉(zhuǎn)染后,,繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時在mRNA水平得到結(jié)果,繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時在蛋白水平得到結(jié)果,。mRNA轉(zhuǎn)染后,,根據(jù)需要在24小時后得到結(jié)果,。
  2.在部分實驗室,,由于血清和培養(yǎng)條件等差異,轉(zhuǎn)染后鏡下培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)少量黑點狀沉淀,,為轉(zhuǎn)染試劑和血清中蛋白結(jié)合產(chǎn)物,,不影響轉(zhuǎn)染結(jié)果和細(xì)胞狀態(tài),可通過換液除去,。
  如遇轉(zhuǎn)染效果不佳,,可采取優(yōu)化方案對實驗進行優(yōu)化:
  1.優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:轉(zhuǎn)染試劑的用量、DNA密度,、細(xì)胞密度,、試劑和DNA混合孵育時間等等。
  2.同時細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡,,轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因,。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。分享一個小秘訣:將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步,,用75%乙醇沉淀,,這樣就除菌了。
  3.轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量,,一般為2μg以上,。如果質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),需要對質(zhì)粒進行純化和濃縮,。
  4.一般進行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期,。如果是貼壁細(xì)胞的話,,貼壁率應(yīng)該在70-80%;如果是懸浮細(xì)胞的話,,應(yīng)該是6×10^5個/孔(24孔板),,一般是轉(zhuǎn)染前一天換液,轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。

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