日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

| 注冊| 產(chǎn)品展廳| 收藏該商鋪

行業(yè)產(chǎn)品

17758005454
當(dāng)前位置:
杭州仟諾生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟及優(yōu)化注意事項(xiàng)

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟及優(yōu)化注意事項(xiàng)

閱讀:1783        發(fā)布時間:2023/4/11
分享:
  懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞生長不依賴支持物表面,在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長,,如淋巴細(xì)胞,。在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常會遇到懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,其和貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染有很大的不同,。
  懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染通??赡苡龅剑?/div>
  1.效率明顯低于貼壁細(xì)胞。
  2.細(xì)胞不易培養(yǎng),,死亡率高,。
  3.轉(zhuǎn)染試劑毒性大,細(xì)胞死亡加劇這三種問題,,為了提高懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,,可以使用毒性較小的非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑,也可以使用電轉(zhuǎn)染方法,,提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,,電擊對細(xì)胞有一定的損傷,,最好選用具有細(xì)胞膜修復(fù)功能的電轉(zhuǎn)染試劑,可以將電擊對細(xì)胞的傷害降到,。
  轉(zhuǎn)染過程中,,操作步驟一定要謹(jǐn)慎。
  以24孔板siRNA轉(zhuǎn)染為例
  1.提前1天細(xì)胞種植
  懸浮細(xì)胞:采用對數(shù)生長期的細(xì)胞,,數(shù)量為常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的1/3進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),。如某細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)是6×10^5,那么就用2×10^5的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。
  2.轉(zhuǎn)染過程
 ?、湃?.67μg(50pmol)的siRNA,加入一定量無血清稀釋液,,充分混勻,,制成RNA稀釋液,終體積為25μl,。
  注意:無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM,、無血清DMEM或1640。
 ?、迫?μl的Entranster-R4000,然后加入24μl無血清稀釋液體,,充分混勻,,制成Entranster-R4000稀釋液,終體積為25μl,。室溫靜置5分鐘,。
  ⑶將Entranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合(可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上)混合,,室溫靜置15分鐘,。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。
 ?、葘?0μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45ml全培養(yǎng)基(可含10%血清和抗生素)的細(xì)胞上,,前后移動培養(yǎng)皿,混合均勻,。
  注意:對本試劑,,采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。
 ?、赊D(zhuǎn)染后6小時觀察細(xì)胞狀態(tài),,如狀態(tài)良好可不必更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時得到結(jié)果,。
  注意:1.siRNA轉(zhuǎn)染后,,繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時在mRNA水平得到結(jié)果,,繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時在蛋白水平得到結(jié)果。mRNA轉(zhuǎn)染后,,根據(jù)需要在24小時后得到結(jié)果,。
  2.在部分實(shí)驗(yàn)室,由于血清和培養(yǎng)條件等差異,,轉(zhuǎn)染后鏡下培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)少量黑點(diǎn)狀沉淀,,為轉(zhuǎn)染試劑和血清中蛋白結(jié)合產(chǎn)物,不影響轉(zhuǎn)染結(jié)果和細(xì)胞狀態(tài),,可通過換液除去,。
  如遇轉(zhuǎn)染效果不佳,可采取優(yōu)化方案對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化:
  1.優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:轉(zhuǎn)染試劑的用量,、DNA密度,、細(xì)胞密度、試劑和DNA混合孵育時間等等,。
  2.同時細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡,,轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌,。分享一個小秘訣:將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步,,用75%乙醇沉淀,這樣就除菌了,。
  3.轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量,,一般為2μg以上。如果質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),,需要對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮,。
  4.一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。如果是貼壁細(xì)胞的話,,貼壁率應(yīng)該在70-80%,;如果是懸浮細(xì)胞的話,應(yīng)該是6×10^5個/孔(24孔板),,一般是轉(zhuǎn)染前一天換液,,轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次。

會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

登錄 后再收藏

提示

您的留言已提交成功,!我們將在第一時間回復(fù)您~

對比框

產(chǎn)品對比 產(chǎn)品對比 二維碼 意見反饋 在線交流
在線留言