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細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及解答
1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊?，shouxuanMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始,。
Gibco RPMI-1640,，杭州仟諾生物科技有限公司常備現(xiàn)貨，現(xiàn)貨直發(fā),。
2. 何時(shí)須更換培養(yǎng)基,？
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間,，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可,。
3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能,。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng),，造成細(xì)胞無(wú)法存活,。
4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類(lèi)？
不能,。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,，,，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活,。
5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS是錯(cuò)誤的使用字眼,，請(qǐng)不要再使用,。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清,。
杭州仟諾生物科技有限公司常備優(yōu)質(zhì)胎牛血清,。
6. 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5% 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響,？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞,。
7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么,？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別,？
HBS和EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高,。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,，溶液會(huì)變堿,，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液,，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了,。
8. 什么是細(xì)胞的接種密度,？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因,。
9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理,？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可,，若培養(yǎng)液太多時(shí),，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止,。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可,。
10. 冷凍管應(yīng)如何解凍,？
取出冷凍管后,，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),，必須注意安全,，預(yù)防冷凍管之爆裂。
11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),， 是否應(yīng)馬上去除DMSO,？
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),，在解凍之后,，應(yīng)直接放入含有10-15 ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題,。
12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理,？
一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4,。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于-20 ℃,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低,，并可減少污染的機(jī)會(huì)。
13. 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？
回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm),，5-10 分鐘,，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡,。
14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何,？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,，必須使用前先行配制完成。
15. DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何,？
冷凍保存使用的DMSO 等級(jí),，必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,，保存于4℃,，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會(huì),。若要過(guò)濾DMSO,，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜。
Sigma D2650,，杭州仟諾生物科技有限公司常備現(xiàn)貨，現(xiàn)貨直發(fā)
16. 冷凍保存細(xì)胞的方法,？
冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。
冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。*-20℃不可超過(guò)1 小時(shí),，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過(guò)此步驟,，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些,。
17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。
18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外,，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
19. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染,？
細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌,、酵母菌、霉菌,、病毒和霉?jié){菌,。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳,、污染的血清和污染的細(xì)胞等,。嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法,。當(dāng)然，適當(dāng)添加抗生素也是防止細(xì)胞污染的途徑
20. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),，應(yīng)如何處理,？
原則上：直接滅菌后丟棄之,。
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先,，確定污染物是細(xì)菌、真菌,、支原體或酵母,，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),，檢查HEPA過(guò)濾器,。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而,，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點(diǎn)在使用抗生素如liangxing霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟,。
(1) 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度,。
(2) 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中,。例如，liangxing霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0,，2.0,，4.0，8.0 mg/ml,。
(3) 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),，如脫落，出現(xiàn)空泡,，匯合度下降和變圓,。
(4) 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代,。
(5) 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代,。
(6) 重復(fù)步驟4。
(7) 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除,。
21. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞,， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能,。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之,。
22. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響,？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究的任一數(shù)據(jù),。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義,。
23. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理,？
直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細(xì)胞株，但是如果您的樣本珍貴,，建議您使用支原體去除試劑去除污染
24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤(pán)如何保持清潔,？
定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。
25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中,， 顏色會(huì)偏暗紅色,，且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,，培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2,，以調(diào)整pH 值。
26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同,？
不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同,，制造程序亦不同,，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長(zhǎng)差異。
27. 購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形,？
研究人員在冷凍細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,，造成細(xì)胞的物理性損傷,，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。
28. 購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,，常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤,。冷凍細(xì)胞解凍后,，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,。細(xì)胞置于-80℃太久。
29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?
我們建議您在使用血清的時(shí)候,，注意下列的操作:
(1) 解凍血清時(shí),，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃),，非常容易產(chǎn)生沉淀物,。
(2) 解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一,，減少沉淀的發(fā)生。
(3) 請(qǐng)勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久,，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量,。
(4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要,，可以無(wú)須做此步驟,。
(5) 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃,，30分鐘的原則,，并且隨時(shí)搖晃均勻,。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻,，都會(huì)造成沉淀物的增多,。
30. L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的,。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
31. GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I,？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用,。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎wanquan降解,。
32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？
酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色,。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用,，（特別是雌激素）,。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞,，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí),，不用加。