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細胞培養(yǎng)常見問題及解答
1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基,？
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長,?？傊瑂houxuanMEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,。
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2. 何時須更換培養(yǎng)基,？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可,。
3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng),，造成細胞無法存活,。
4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能,。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,，,，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活,。
5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS是錯誤的使用字眼,，請不要再使用,。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清,。
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6. 培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用5% 或10% CO2？或根本沒有影響,？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時，則應(yīng)使用5% CO2 培養(yǎng)細胞,。
7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,，不需要CO2培養(yǎng)箱,。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別,？
HBS和EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高,。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,，溶液會變堿,，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液,，如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了,。
8. 什么是細胞的接種密度,？
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因,。
9. 懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理,？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可,，若培養(yǎng)液太多時,，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止,。分瓶時取出一部份含細胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可,。
10. 冷凍管應(yīng)如何解凍,？
取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂,。
11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感的細胞外,，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),，在解凍之后,，應(yīng)直接放入含有10-15 ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題,。
12. 附著性細胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理,？
一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4,。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低,，并可減少污染的機會。
13. 欲將一般動物細胞離心下來,，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？
回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm),，5-10 分鐘,，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡,。
14. 細胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何,？
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細胞液中,，必須使用前先行配制完成。
15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何,？
冷凍保存使用的DMSO 等級,，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況,，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,，保存于4℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),，并可減少污染的機會,。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜,。
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16. 冷凍保存細胞的方法,？
冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。
冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存,。*-20℃不可超過1 小時,，以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟,，接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些。
17. 細胞欲冷凍保存時,， 細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度,？
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。
18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
19. 應(yīng)如何避免細胞污染,？
細胞污染的種類可分成細菌,、酵母菌、霉菌,、病毒和霉?jié){菌,。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳,、污染的血清和污染的細胞等,。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法,。當(dāng)然，適當(dāng)添加抗生素也是防止細胞污染的途徑
20. 如果細胞發(fā)生微生物污染時,，應(yīng)如何處理,？
原則上：直接滅菌后丟棄之。
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時,，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先，確定污染物是細菌,、真菌,、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開,，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,，因而,，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點在使用抗生素如liangxing霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟,。
(1) 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度,。
(2) 分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個孔中,。例如，liangxing霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0,，2.0,，4.0，8.0 mg/ml,。
(3) 每天觀測細胞毒性指標(biāo),，如脫落，出現(xiàn)空泡,，匯合度下降和變圓,。
(4) 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代,。
(5) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代,。
(6) 重復(fù)步驟4。
(7) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代,，確定污染是否以已被消除,。
21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀,？
不能,。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株,，無法以其外觀分辨之,。
22. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數(shù),，代謝及研究的任一數(shù)據(jù),。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free,，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義,。
23. 偵測出細胞株有支原體污染時,， 該如何處理？
直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細胞株,，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染
24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔,？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之,。
25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色,，且pH值會越來越偏堿性,？
培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,，將造成細胞生長停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2,，以調(diào)整pH 值。
26. 各種細胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同,？
不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同,，制造程序亦不同,，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異,。
27. 購買的細胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少的情形？
研究人員在冷凍細胞的培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少,，大都是因為離心過程操作上的失誤,，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失,。建議細胞解凍后不要立刻離心,，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
28. 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因,？
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳,。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后,，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤,。細胞置于-80℃太久。
29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?
我們建議您在使用血清的時候,，注意下列的操作:
(1) 解凍血清時,，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),，非常容易產(chǎn)生沉淀物,。
(2) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一,，減少沉淀的發(fā)生。
(3) 請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久,，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量,。
(4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要,，可以無須做此步驟,。
(5) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃,，30分鐘的原則,，并且隨時搖晃均勻。溫度過高,，時間過久或搖晃不均勻,，都會造成沉淀物的增多。
30. L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎,？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？
L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解,，但是確切的降解率一直沒有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
31. GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I,？這個二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護,。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用,。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121℃滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎wanquan降解。
32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？
酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色,，酸性時為黃色，堿性時為紫色,。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應(yīng),，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時,，不用加,。