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如何做好細胞培養(yǎng)
養(yǎng)細胞是一件戳心戳肺的事情,，你要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護她,，呵護她,。如果你照顧的時候能注意這些問題，會讓你的細胞養(yǎng)的更好,。下面小編就將養(yǎng)細胞的注意事項跟大家交流一下,。
細胞培養(yǎng)前的準備
細胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細胞與基質(zhì)解離以及細胞質(zhì)空泡形成,。
這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致,，例如：培養(yǎng)物污染、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì),，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基,。
變質(zhì)嚴重時將會成為不可逆的變化。
細胞培養(yǎng)通風櫥的消毒及布局
保持細胞培養(yǎng)通風櫥內(nèi)的整潔有序,，將所有物品置于直視范圍內(nèi),。
向放入通風櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒,。
在通風櫥中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器,；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸??；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液,。
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培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作
細胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基,、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素,、增塑劑和去污劑,。
生物污染物，如細菌,、霉菌,、酵母、病毒,、支原體以及其他細胞系的交叉污染,。
可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。
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交叉污染的確認
為細胞換液時,，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入,，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞,，當培養(yǎng)的細胞株較為脆弱時尤其需要注意,。
使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次,，以免交叉污染,。
細胞傳代的時間把握
當細胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養(yǎng)的細胞已占據(jù)所有可用基質(zhì),、沒有擴增空間，或懸浮培養(yǎng)的細胞已超過培養(yǎng)基質(zhì)所支撐的能力,，無法進一步生長時,，細胞增殖速度將大大降低甚至wanquan停止。
為了將細胞密度維持在最佳水平,，以便細胞繼續(xù)生長,，并且刺激進一步增殖，必須對細胞進行傳代,。
細胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項
細胞培養(yǎng)時不應(yīng)長期使用抗生素,，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在,。
抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用,，并盡快撤除。
如果長期使用抗生素,，則應(yīng)同時進行無抗生素培養(yǎng),，以便作為鑒別隱性感染的對照。
細胞凍存的必要性
連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變,，有限細胞系最終會發(fā)生衰老,，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉(zhuǎn)情況zuihao的實驗室也會遇到設(shè)備故障的問題,。
由于已建立的細胞系是一種寶貴資源,，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間,，因此,，必須將其冷凍起來，長期保存。
細胞凍存的必要性
連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變,，有限細胞系最終會發(fā)生衰老,，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉(zhuǎn)情況zuihao的實驗室也會遇到設(shè)備故障的問題,。
由于已建立的細胞系是一種寶貴資源,，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間,，因此,，必須將其冷凍起來，長期保存,。
細胞凍存的事項
應(yīng)在細胞濃度高的情況下進行細胞培養(yǎng)凍存,，并且細胞傳代的次數(shù)盡可能少。
在凍存前確?；罴毎陌俜直戎辽贋?0%,。請注意，最佳凍存條件取決于所用細胞系,。
凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影響,，因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細胞脫落（培養(yǎng)昆蟲細胞時除外），也不要高速離心細胞,。
凍存培養(yǎng)基的選擇
凍存細胞時必須選擇凍存培養(yǎng)基,，凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。
還可使用專門配制wanquan凍存培養(yǎng)基,，例如Sigma,、Gibco的細胞凍存培養(yǎng)基。
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細胞培養(yǎng)溫度的設(shè)定
細胞培養(yǎng)的最佳溫度主要取決于細胞供體的體溫,，此外也受到解刨部位體溫差異的影響,，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。
與溫度過低相比,，細胞培養(yǎng)時溫度過高是更為嚴重的問題,；因此，往往將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為略低于最佳溫度,。
各類細胞培養(yǎng)的最佳溫度
大多數(shù)人和哺乳動物細胞系在36℃~37℃下具有最佳生長狀態(tài),。
昆蟲細胞在27℃具有最佳生長狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內(nèi),，細胞生長較慢,。
溫度超過30℃時，昆蟲細胞活力降低，即使溫度降至27℃,，細胞活力也無法恢復(fù),。
禽類細胞系在38.5℃時具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細胞也可在37℃下培養(yǎng),，但其生長速度會變慢,。
來源于冷血動物（例如：兩棲動物、冷水魚）的細胞系可耐受很寬的溫度范圍,，為15-26℃,。
請注意每種細胞的培養(yǎng)條件均有所不同，偏離某種細胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細胞表型異常,，甚至培養(yǎng)wanquan失敗,。
因此，我們建議您應(yīng)熟悉自己使用的細胞系,，實驗中嚴格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說明,。
細胞培養(yǎng)的最適pH
大多數(shù)正常的哺乳動物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細胞株間差異極小,。
但是,，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時生長較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7,。
Sf9和Sf21等昆蟲細胞系zuishihe在pH值為6.2的環(huán)境中生長。
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細胞培養(yǎng)基最適pH的控制
細胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值,，為培養(yǎng)的細胞緩沖pH值的變化,。
這種緩沖作用通常是通過添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。
由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡,，因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值,。
為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時必須使用外源性二氧化碳,，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞或者進行高濃度的轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)時,。
細胞培養(yǎng)中血清的保存
細胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細胞種類和培養(yǎng)要求來挑選出zuishihe的血清,。
我們建議將血清保存在-10至-20℃,，若存放于4℃，請勿超過一個月,。
若您無法一次用完一瓶,，建議您將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內(nèi)，再放回冷凍箱保存。
解凍血清時,，建議您將血清從冷凍箱取出后,，先置于2-8℃冰箱過夜融解，然后在室溫下使之全融,。需要注意的是,，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。
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如何在細胞鋪板時避免“邊緣效應(yīng)"
細胞實驗鋪板時,，為避免“邊緣效應(yīng)",，以應(yīng)用96孔板的中間60孔為最佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細胞,，只做空白或陰性對照,。
鋪板時，細胞懸液一定要混勻,，以避免細胞沉淀下來而導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不等,，可以每接幾個就再混勻一下。
加樣器操作要熟練,，盡量避免人為誤差,。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力,。所以要熟練操作,，盡快上板。