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采用試劑盒因子法體外培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法
Nk細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞,，是人體內(nèi)抗癌活性免疫細(xì)胞之一,，它在骨髓中發(fā)育成熟后，主要存在于外周血,、肝臟,、腹膜腔和胎盤中，在遇到腫瘤病變細(xì)胞時就會把它們殺死,，同時也會刺激身體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng),，所以被醫(yī)學(xué)界稱為“抗癌的第1道防線”。
NK細(xì)胞主要分布于外周血,，占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5-10％,，無需抗原提呈細(xì)胞作為中介提呈抗原，也無需抗體幫助,，可直接清除衰老細(xì)胞,、變性細(xì)胞、癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等,。
NK細(xì)胞屬于白細(xì)胞的一種,，它是人體忠誠的衛(wèi)士，主要任務(wù)就是消滅那些已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞,，從而把病毒消滅在“搖籃”中,。另外，身體里面的腫瘤細(xì)胞也是它們追殺的對象。
NK細(xì)胞在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起到非常重要的作用,，是一種有效,、安全的腫瘤生物免疫治療方法，具有廣闊的應(yīng)用前景,。
分離培養(yǎng)NK細(xì)胞有多種方法,，以下是采用某種試劑盒的因子法體外培養(yǎng)方法來培養(yǎng)NK細(xì)胞：
這種方法采用自體外周血細(xì)胞中分離得到的單個核細(xì)胞，經(jīng)體外操作使NK細(xì)胞擴(kuò)增活化,，通過激活體 內(nèi)特異性免疫反應(yīng)達(dá)到殺火腫瘤細(xì)胞目的的一種體細(xì)胞治療方法,。
1.NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包含：
①無血清培養(yǎng)基2瓶（l000mL/瓶）：
②NK試劑A, 1支：
③NK試劑B, 1支：
④NK試劑C, 1支:
⑤NK試劑D, 1支：
⑥NK試劑E, 1支：
培養(yǎng)體系中需用到2支（100萬IU/支）rH IL-2
2.原材料
1.采取外周血（可從臍血、骨髓等組織）
2.需的試劑耗材包括：
0.4%苔盼藍(lán)溶液,、生理鹽水,、人淋巴細(xì)胞分離液（建議選用GE）、175cm²培養(yǎng)瓶,、GT-T610 （A）培養(yǎng)袋,、15ral/50ml/250ml離心管、移液管,、1毫升無菌注射器
3.NK細(xì)胞培養(yǎng)時間過程:
前一天：要提前處理好細(xì)胞活化瓶（NK試劑A）
第1天：進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)(NK試劑B）
第3天：NK細(xì)胞第1次補(bǔ)液,，補(bǔ)液50ml（NK試劑C）
第5天:NK細(xì)胞第二次補(bǔ)液，補(bǔ)液175ml (NK試劑D）
第7天：NK細(xì)胞第三次補(bǔ)液,，裝袋并補(bǔ)液500ml (NK試劑E)
第9-10天：NK細(xì)胞第四次補(bǔ)液，分袋并補(bǔ)液750ml
第12天：NK細(xì)胞第五次補(bǔ)液.補(bǔ)液500ml
第13天：檢菌
第14,、15天：培養(yǎng)成功
（細(xì)胞培養(yǎng)成功時間視具體細(xì)胞生長情況而定,，在保持培培養(yǎng)基ph和細(xì)胞活力正常的情況下也可以多培養(yǎng)一天）
4.具體操作步驟如下：
1.頭一天一定要先處理細(xì)胞活化瓶。
2.將NK試劑A （4度保存）加入到含有12.5ml生理鹽水的175cm²底面積細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，充分的混勻 30秒-1分鐘,使液體充分在瓶底分散,，4度冰箱平放過夜
(NK試劑A需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底；次日取出后直接吸棄液體即可,，無需清洗）
3.外周血單個核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)（第1天）
4.以100ml外周血為例,，如血量不同，也可按操作規(guī)程做相應(yīng)調(diào)整,。
5.將患者外周血,，用移液訝吸取少許原血（約300 ul）劃線或滴入平皿過行檢菌。然后,，正常室溫下,進(jìn)行離心,。
6.將上層血漿轉(zhuǎn)入離心，滅活,，離心,，取上清液備用。
7.使用等體積的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀混勻后,，小心加到Ficoll層上,，使分層保持清晰,。室溫內(nèi)進(jìn)行離心。
8.吸取外周血單個核細(xì)胞(PBMC）層,，盡量吸盡兩液面交接處的細(xì)胞層.加生理鹽水吹打混勻,，離 心。相同方法冉次洗滌細(xì)胞,。
9.棄去上清后,，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。
10.按照細(xì)胞密度為1-2*10^6個/ml(5 *10^6個/ml）,用培養(yǎng)基清洗離心管,，并入培養(yǎng)瓶內(nèi),，并加入1支NK試劑B，患者滅活血漿1.25ml (5%）確保培養(yǎng)基終體積為25ml左右,。剩余血漿4°C 密封保存?zhèn)溆谩?br /> 注：包被瓶取出時間為細(xì)胞加入前5分鐘,其他時間需在4度放置備用,。
試劑A、B,、C,、D、E的取用.違議第1次吸取原液后.以適貴培養(yǎng)基沖洗西林瓶后再吸出,，以大程度減少損耗
11.活化培養(yǎng)基的配置：其中1瓶無血清培養(yǎng)基中,，加入100萬IU的IL-2，終濃度為1000IU/mL,。
注：活化培養(yǎng)基每次使用前恢復(fù)至室溫,。
12.NK細(xì)胞的第1補(bǔ)液（第3天），補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑C,，確保培養(yǎng)的終體積為 75mL,。
13.NK細(xì)胞的第二次補(bǔ)液（第5天），補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑D,確保培養(yǎng)的終體積為 250ml.
14.NK細(xì)胞的第三次補(bǔ)液及其裝袋（第7天）,，細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞,，隨后將培養(yǎng)瓶的中的細(xì)胞懸液及其500mL活化培養(yǎng)基，裝入到細(xì)胞培養(yǎng)袋中,，同時加入1支NK試劑E,，及其剩余的全部血漿，確保終體積為750ml,。
15.NK細(xì)胞的第四次補(bǔ)液（第9天）,，主要為分袋操作，將培養(yǎng)體系由750ml擴(kuò)增至1500ml,。
16.NK細(xì)胞的第五次補(bǔ)液（第!2天）.主要為補(bǔ)液操作,，將剩余的500mL擴(kuò)增液均分到2個培養(yǎng)袋中，確保每袋體積為1000ml。
17.檢菌,，細(xì)胞培養(yǎng)第13天,，對細(xì)胞懸液進(jìn)行檢菌、內(nèi)毒素檢測,。用5ml注射器分別從培養(yǎng)瓶和袋內(nèi)抽取少細(xì)胞懸液,，加入正置的平皿中，放入35℃恒溫生化培養(yǎng)箱,， 記錄放入日期及培養(yǎng)物品,。隔夜后倒置，保留48小時,。
18.收獲,，正常情況下，第13, 14天各收獲1000ml細(xì)胞懸液,。若因臨床需要進(jìn)行提前或延遲回輸,，也可相應(yīng)提前或延遲。（NK細(xì)胞建議2-4h之內(nèi)使用,，以保證其活性）