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細胞培養(yǎng)：血清與污染以外值得重視的問題-細胞老化
常有用戶提到細胞狀態(tài)不好,，比如：細胞不再透亮,，內(nèi)部有很多細碎的小黑點,，細胞形態(tài)不規(guī)則,，培養(yǎng)液變黃……
這時,，除了考慮血清和細菌污染的問題，細胞老化也不容忽視~
何為細胞老化,？
1882年,，德國生物學家Weismann曾大膽預測“在細胞水平存在老化現(xiàn)象”。他推測：機體的壽命限制受控于體細胞的分裂能力,；在遺傳進化中,，不同物種的體細胞獲得了不同分裂的潛能，從而決定了不同物種的壽命長短,。
20世紀50年代,，Swin和他的同事利用原代細胞體外培養(yǎng)試驗證明了來源于不同物種的纖維細胞均不具備無限分裂的潛能。取得突破性進展的還是Hayflflick和Moorhead,，他們做了更系統(tǒng)更細致的觀察和描述,，他們對25株人成纖維細胞進行原代培養(yǎng)，在這個過程中發(fā)現(xiàn),，經(jīng)過約50次傳代之后,，所有細胞出現(xiàn)功能退化，并且喪失分裂能力的現(xiàn)象,。此后人們將這一現(xiàn)象稱之為“Hayflflick極限”或者自發(fā)性老化,。之后也有事實證明，細胞老化并不是體外培養(yǎng)所導致,，細胞在體內(nèi)也會隨著年齡的增長,，逐步走向老化。
細胞老化的基本特征？
細胞周期阻滯
長期的細胞周期阻滯是老化細胞的基本特征,，也是體外鑒定細胞老化*的指標,。為了檢查細胞是否躍出了細胞周期，人們通常檢測增殖指示分子Ki-67的表達豐度,；或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine,，BrdU）摻入到細胞培養(yǎng)基中，觀察是否有新的DNA合成,。細胞老化主要表現(xiàn)為G1期阻滯,，個別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯，或直接由G2/M期阻滯誘發(fā)形成,。
細胞形態(tài)改變
雖然由于細胞周期的中斷和DNA復制的停止,，老化細胞內(nèi)的DNA含量與正常細胞類似，但 RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細胞要明顯升高,。這是因為,，盡管細胞進入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制,，導致蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)持續(xù)堆積,。但，由于不同組織來源的細胞,，其形態(tài)本就各不相同,，因此，目前還并無客觀的,、統(tǒng)一的標準從細胞形態(tài)判斷并定義老化細胞,。換句話說，目前并不能直接根據(jù)細胞的形態(tài)去判斷是否老化細胞,。
無論是原代細胞或是細胞株,，在細胞培養(yǎng)過程中細胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略,，老化的細胞會出現(xiàn)的特征包括：細胞增殖變慢,、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多,、細胞體積增大,、細胞扁平、細胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象,。
總結如下
- 細胞老化開始的現(xiàn)象通常為細胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體）,，也可能會出現(xiàn)黑點，大多沿細胞周邊排布,，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些,，但相對周邊較少,；
- 老化的細胞會出現(xiàn)細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮,，胞膜起泡,，皺縮等現(xiàn)象；
- 老化以后的細胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失,，開始成扁平狀,，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起，細胞不再是梭形,，而會成為各種不規(guī)則形狀,；
- 細胞折光性變差，鏡下可見細胞“變薄”,，做轉染實驗時,，細胞死亡率會較高，但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象,，仍清亮,。（如果是細菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃,，混濁,，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話,，細胞也會失去正常形態(tài)，會有細胞的死亡）,；
- 細胞的貼壁性減弱,，開始有細胞漂浮在培養(yǎng)液中；
- 老化的細胞表面分泌物會增多,，細胞表面的純凈度越來越低,；
- 分裂的細胞數(shù)量明顯的減少，同時細胞的增殖速度也會大大下降,；
- 細胞開始長角分化,。
如下圖：
▲ 圖1 HEK293細胞 ▲圖2 MSC細胞
圖1 實心箭頭指示的是發(fā)生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽性,，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細胞,。
圖2 被染上藍色的是發(fā)生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細胞。
由圖片可以看出老化細胞體積增大,、細胞扁平,。
細胞培養(yǎng)中如何預防老化？
- 防止細胞老化主要還是要做到勤觀察,、勤換液,、勤傳代,、勤保種，特別是傳代,，不能等細胞太密了之后傳,，一般細胞建議長到70％融合度傳代完好；
- 換培養(yǎng)液應該根據(jù)自己細胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換,。如果感覺時間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細胞,，在不同的時間換液，后再來比較下,，看什么時候換液好,，得出自己的結論；
- 選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細胞對血清特別敏感,，直接影響細胞的生長,。一定要選擇適合的血清不然就會因營養(yǎng)物質(zhì)不協(xié)調(diào)而導致細胞老化；
- 在間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)時必然要進行消化,，但是消化對細胞的表面蛋白質(zhì)有很強的破壞作用,，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化,；
- 在開始養(yǎng)細胞并傳代時,，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在,，可以有效避免細胞損傷,。
雖然，老化細胞不會立即死亡,，但其基因表達會發(fā)生變化,，如果細胞老化現(xiàn)象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復蘇細胞,。
在進行細胞培養(yǎng)時,，我們經(jīng)常會聽到一些專業(yè)名詞，原代培養(yǎng)是什么,？什么是世代數(shù),？細胞系是什么？有限細胞系又代表的是什么,？有的專有名詞搞不清楚的話,，會對細胞培養(yǎng)過程也會有一定的影響。根據(jù)老師們的反饋,，我們總結了以下容易混淆的概念供大家參考~
1,、原代培養(yǎng)（Primary culture）
開始于直接取自生物體的細胞、組織或器官的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng),。通常代表異質(zhì)細胞群,，很難標準化和繁殖,。它們的壽命一般有限，而且已知它們會隨著時間而改變其差異特征,。
2,、傳代（Passage(Subculture)）
細胞從一個皿里轉移或傳代到另一皿里的過程稱為細胞傳代。這是一個操作行為,，無法準確定義細胞分裂次數(shù),。
3、傳代次數(shù)（Passage number）
一種細胞被傳代培養(yǎng)的次數(shù)稱為傳代次數(shù),。
4,、世代數(shù)（Generation number）
一種細胞所經(jīng)歷的細胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為世代數(shù)。
5,、群體倍增時間（Population doubling time）
在對數(shù)生長期中期細胞數(shù)量翻倍所需要的時間間隔稱為群體倍增時間,。
6、群體倍增次數(shù)（Population doubling）
在培養(yǎng)過程中細胞所經(jīng)歷的細胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為群體倍增次數(shù),。
7,、細胞系（Cell line）
原代細胞經(jīng)過第①次傳代后增殖的細胞稱為細胞系或亞克隆。隨著細胞的傳代,，生長能力強的細胞會占據(jù)優(yōu)勢,，終導致細胞群體在基因型和表現(xiàn)型上達到一定程度的均一性。
8,、細胞株（Cell strain）
細胞系通過選擇或克隆獲得的具有特征的細胞系稱為細胞株,。與親代細胞系起始時相比，細胞株往往會獲得其他一些遺傳學改變,。
9,、有限細胞系（Finite cell line）
通過傳代增殖但在體外只能增殖有限細胞數(shù)量的一種細胞稱為有限細胞系（通常60-70倍增次數(shù)）。
10,、衰老（Senescence）
與染色體端粒縮短相聯(lián)系的生物調(diào)控的增殖潛力損失稱為細胞衰老,。存活的細胞也可能保留一些功能活性,。
11、永生化（Immortalization）
獲得無限的壽命,，可能是細胞自發(fā)產(chǎn)生的,，也可能是以轉染引起的。
12,、無限細胞系（Infinite/immortal/strain）
具有無限增殖能力的細胞系或細胞株稱為無限細胞系/連續(xù)細胞系,。
13、平板效率（Plating efficiency）
在傳代培養(yǎng)中產(chǎn)生集落的細胞的百分比稱為平板效率,。如果每個集落都可以說是來自一個細胞,，那么平板效率等同于克隆效率/集落形成效率,。有時，平板效率被粗略地用來描述傳代培養(yǎng)后存活的細胞數(shù)量,，但這被更好地稱為種子效率,。
Reference：
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