腦類器官通常從人多能性干細胞(ESCs/iPSCs)開始培養(yǎng),，自發(fā)形成腦發(fā)育早期所具備的結(jié)構(gòu)和層次,。但腦細胞團簇達到一定尺寸后，可發(fā)育的階段會受到營養(yǎng)缺乏和氧供應(yīng)的限制,，繼而神經(jīng)元開始死亡,，結(jié)構(gòu)停止發(fā)育。 目前,，大腦類器官的培養(yǎng)主要分為兩種方法,，引導(dǎo)分化法 (Guided)和非引導(dǎo) (Un-guided)分化法。 ①非引導(dǎo)分化法依賴于細胞自身的形態(tài)發(fā)生和內(nèi)在的分化能力,，將外在干擾小化,，得到的類器官有前腦、中腦,、后腦,、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)叢等多種細胞譜系，該種方法的缺陷在于高可變性和異質(zhì)性,。 ②而引導(dǎo)分化法是加入一些外源性的模式因子,，誘導(dǎo)hPSCs分化為想要的細胞譜系。 在類器官結(jié)構(gòu)中,，多能性干細胞(ESCs/iPSCs)誘導(dǎo)為擬胚體 (Embryoid Body, EB),，在外胚層形成后，引導(dǎo)分化為神經(jīng)或非神經(jīng)方向,。引導(dǎo)分化法獲得的類器官依賴分化過程中添加的生長因子,，大多數(shù)是腦區(qū)特異性的，如皮層,、海馬,、中腦、大腦等,。引導(dǎo)分化法得到的類器官含有神經(jīng)祖細胞,、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及其他的大腦細胞,。由于是引導(dǎo)性分化,，批次間的可變因素少，可以產(chǎn)生對應(yīng)比例的特異性細胞類型,。很多團隊都在嘗試用不同的方法來培養(yǎng)類器官,，分別培養(yǎng)腦區(qū)特異的類器官后再將其共培養(yǎng)，類器官會自我融合形成含有不同腦區(qū)的類器官,，該模型可以用于研究腦區(qū)間的相互作用,。 |
誘導(dǎo)EB形成 1-2h | 1. 當(dāng)ESCs/iPSCs在六孔板中長到融合度為70-80%時用于誘導(dǎo)EB,，通常每個六孔板孔的細胞可用于誘導(dǎo)一整個96孔板。
注：干細胞克隆的形態(tài)對于大腦組織形成的成功與否非常關(guān)鍵,?？寺⌒璩尸F(xiàn)多能性的特征 (如邊緣清晰，克隆緊密等),，且無分化傾向,；
對于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ESCs/iPSCs：
① 用1ml的無鈣鎂的D-PBS洗滌細胞后，向每孔中加入600μl的含0.5mM的EDTA的無鈣鎂的D-PBS溶液,。培養(yǎng)箱孵育4min,；
② 輕柔吸出EDTA溶液，注意不要破壞克隆,，加入1ml的Accutase,。放回培養(yǎng)箱孵育4min；
③ 用1ml的mTeSR1培養(yǎng)基吹散克隆,，使其從培養(yǎng)皿底部脫落,。轉(zhuǎn)移2ml至15ml離心管中，用1ml移液器將克隆吹散為渾濁的單細胞懸液,；
④ 270g 室溫離心細胞5min,，同時用臺盼藍檢測死細胞，用血細胞儀或自動細胞計數(shù)儀細胞計數(shù),；檢測兩次取平均值,；
⑤ 用1ml的含50μM的ROCK抑制劑Y-27632的低bFGF的ESCs培養(yǎng)基重懸細胞，吹打,，保證細胞呈單細胞重懸的狀態(tài),。然后，用含Y-7632的低FGF-2的培養(yǎng)基重懸細胞,，使細胞濃度為每150μl含9000個活細胞,；
⑥ 每個96孔板孔中放入150μl的細胞懸液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),； | 飼養(yǎng)EB,早期胚層分化 5-7d | 2. 24h后,，顯微鏡下觀察,可見有清晰邊緣的小的EB形成,邊緣有許多死細胞圍繞在EB周圍,為正?，F(xiàn)象，不會干擾EB在中間形成,繼續(xù)置于37℃的5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
3. 隔天輕柔地吸去半量培養(yǎng)基,避免干擾到EB和底部的細胞,補充150μl的新鮮培養(yǎng)基(總體積會大于150μl,量的準(zhǔn)確與否不重),培養(yǎng)基中添加Y-27632(1:100),FGF-2濃度為4ng/ml,直到EB直徑大于350-450μm為止,通常,僅前4天需要添加二者,；
4. EB直徑達到350-600μm時，用3中的培養(yǎng)基隔天飼養(yǎng)EB,培養(yǎng)基中不含Y-27632和FGF-2,； | 原始神經(jīng)上皮的誘導(dǎo) 4-5d | 5. EB直徑達到500-600μm時,，邊緣開始變得明亮，并且呈現(xiàn)光滑的邊緣 (通常為第6天),，將每個EB用剪掉槍頭的200μl移液器轉(zhuǎn)移至含有500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的低吸附24孔板中,，輕柔且不要破壞EB，繼續(xù)培養(yǎng),； 注：將200μl移液器槍頭剪掉,，使開口直徑約為1-1.5mm。確保開口不要太小,，避免破壞EB,，但也不能太大，太大會難以吸去EB,。不要試圖用刮刀將EB鏟出,，會破壞EB的結(jié)構(gòu)；
6. 轉(zhuǎn)移至24孔板后,，另外加入500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基飼養(yǎng)EB,；
7. 2d后，組織培養(yǎng)顯微鏡觀察EBs,，形態(tài)邊緣變得更加明亮,，提示神經(jīng)外胚層的分化；一旦這些區(qū)域開始顯示與神經(jīng)上皮形成一致的假復(fù)層上皮的放射狀組織,，這一般發(fā)生在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的4-5d后,，繼續(xù)進行第8步，將組織聚集轉(zhuǎn)移到Matrigel液滴中,；
注：健康的細胞聚集有光滑的邊緣,，神經(jīng)上皮邊緣在光學(xué)上呈半透明狀。有時組織可能在光學(xué)上表現(xiàn)為非放射狀組織的半透明組織,，雖然這不是理想狀態(tài),，但沒有觀察到這對類器官形成有長期的負面影響。重要的是,，如果在神經(jīng)誘導(dǎo)中再多放置1-2天,，這些非放射區(qū)域就會變成放射狀，但是如果不及時轉(zhuǎn)移到基質(zhì)凝膠(步驟8),，其他已經(jīng)放射狀的區(qū)域可能開始收縮并失去形成神經(jīng)上皮芽的能力,。當(dāng)有神經(jīng)外胚層出現(xiàn)時,，需盡快將組織轉(zhuǎn)移到Matrigel中，如果太晚,，會影響腦組織的晚期形態(tài),； | 將神經(jīng)外胚層組織轉(zhuǎn)移至Matrigel液滴中 1-2h | 8. 4℃下冰上解凍Matrigel。觀察發(fā)現(xiàn),，500μl的Matrigel在冰水混合物浴時，1-2h后會恢復(fù)液體狀態(tài),； 9. 將Parafilm膜置于一個空的帶有凹坑的中號槍頭盒上,，將手指按向Parafilm膜形成凹坑，每個坑的體積約為200μl,；
注：Parafilm不能高壓滅菌,，所以不能*滅菌，因此需保證Parafilm膜保存在干凈的環(huán)境中,，準(zhǔn)備凹坑前,，向手套和Parafilm膜噴灑70%乙醇消毒；在這一步也可以在培養(yǎng)基中添加抗生素以避免污染,；
10. 將Parafilm膜用剪刀修剪為單個含4x4(共16個)凹坑大小的正方形,，將其放入60mm的組織培養(yǎng)皿中；
11. 用200μl的移液器轉(zhuǎn)移神經(jīng)外胚層組織,，每個凹坑中放置1個,；
注：將200μl移液器槍頭剪掉，使開口直徑約為1.5-2mm,。確保開口不要太小,，避免破壞EB，但也不能太大,，太大會難以吸去EB,。不要試圖用刮刀將EB鏟出，會破壞EB的結(jié)構(gòu),；
12. 用未剪頭部的200μl移液器小心地吸去組織邊緣多余的培養(yǎng)基,；
13. 每個組織快速滴入Matrigel，每孔約30μl,，使Matrigel滴入Parafilm凹坑中,；
注：快速滴入Matrigel，避免組織干掉,。盡量一次性滴入Matrigel,，一次性包埋好16個組織；
14. 用10μl的移液槍頭移動組織,，使組織位于液滴的中央,，這一步需要在滴入Matrigel后立即進行,，因為室溫下Matrigel非常容易固化；
15. 將此60mm培養(yǎng)皿置入37℃培養(yǎng)箱中,，孵育20-30min以使Matrigel聚合,；
16. 取出60mm培養(yǎng)皿，加入5ml不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基,；
17.將Parafilm膜反過來并搖動培養(yǎng)皿,，直至Matrigel液滴從凹坑中滴入培養(yǎng)基中；不容易脫落的液滴可以用鑷子用力晃動Parafilm膜使其脫落,，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)組織,。 | 神經(jīng)上皮芽的固定培養(yǎng) 4d | 18. 24h后，觀察包埋的組織,，1-3d內(nèi),，組織會呈現(xiàn)包含液體空腔的進一步擴張的神經(jīng)上皮樣； 注：從Matrigel主體中會遷移出一些細胞類型,，通常呈成纖維細胞樣,，這些細胞代表了非神經(jīng)特性的群體，從神經(jīng)誘導(dǎo)時逃脫出來,；然而這些細胞通常不能生存,，且遷移出來后，對神經(jīng)上皮芽的形成呈現(xiàn)促進作用,；
19. 將液滴繼續(xù)培養(yǎng)24h,，然后將培養(yǎng)基更換為不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h,；
注：換液時,，傾斜培養(yǎng)皿使液滴下沉，輕柔吸出培養(yǎng)液,。盡量在不破壞類器官的情況下,，吸出更多的培養(yǎng)液。更換為5ml的新鮮培養(yǎng)液,； | 腦組織的生長 ~1年 | 20. 4h的靜止培養(yǎng)后,，用開口約為3mm的剪去頭部的1ml移液槍頭將包埋好的類器官轉(zhuǎn)移至125ml的震動反應(yīng)器中，加入75~100ml的含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)液,，將此生物反應(yīng)器放置在培養(yǎng)箱中安裝的磁攪拌板或軌道振動篩上用85rpm的速度震動,。也可以將60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液更換為含Vitamin A的腦類器官培養(yǎng)液，將其置于軌道振動篩上培養(yǎng),； 注：每個生物反應(yīng)器中不要轉(zhuǎn)移超過2個60mm培養(yǎng)皿的類器官(32個),，太多類器官會引起類器官的融合；
使用低速攪拌攪拌板，因為常規(guī)速度的攪拌棒會因磁力攪拌而引起發(fā)熱,；
軌道振動篩可用于分析多種培養(yǎng)條件,，同時使用多種基因突變劑處理，而傳統(tǒng)的攪拌板只能同時防止4-6個單獨的瓶,；用生物反應(yīng)器和軌道振動篩培養(yǎng)的腦類器官未觀測到有區(qū)別,；
21. 振動篩上的類器官每3-4天全量換液，搖瓶上的類器官每周換液,，注意觀察形態(tài),；在合適的時間點取樣本用于實驗研究； |
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