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腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞,。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是多的,。另外腫瘤對人類是威脅大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理,、抗癌藥檢測,、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用,。
一,、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性
腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外,，在形態(tài),、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同,。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,，其差異較小，但也并非*相同,。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)：
（－）形態(tài)和性狀
培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài),，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜,、核仁輪廓明顯,，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密,，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則,，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動和錨著不依賴性有關(guān)。
（二）生長增殖
腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性,，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖,，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子,，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力,。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后,，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細(xì)胞惡變的一個指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時,，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時,，接觸抑制消除,，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物,。
（三）永生性
永生性也稱不死性,。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀,，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無直接證明,。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在,。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時同樣如此,？也尚難肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過程說明,，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的,，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上,，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時并不那么容易,。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細(xì)胞后,，也大多增殖若干代后,，便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性,，順利傳代生長下去,。從而說明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細(xì)胞系,，如NIH3T3,、Rat－1、10T1/2等細(xì)胞證明,，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀,，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性,?？赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此,。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為,，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀,。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中,，并有穿透人工隔膜生長的能力,。
（五）異質(zhì)性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性,、起源,、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織,；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多,，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化,，有的處于周期阻滯狀態(tài),，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分,。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時易于生長增殖,；把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。
（六）細(xì)胞遺傳
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變,，如失去二倍體核型,、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成,，有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系,，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。
（七）其它
腫瘤細(xì)胞在體外不易生長的原因可能由于：
①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長力,，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系,。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴,。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系,，可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性；
②腫瘤細(xì)胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋,，達(dá)不到腫瘤生長的需求,，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力；
③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長活力和長的Life Span,，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長能力,，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；
④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件,。
二,、培養(yǎng)方法
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除,、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面,。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別,，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可,。
1．取材：
人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要,，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位,。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料,。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng),，可貯存于4℃中,，但不宜栽過24小時。
2．培養(yǎng)基：
腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格,，一般常用的 RPMIl640,、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低,，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長,。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大,，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞*不需要這些成分,。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間,、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對生長因子的需求都存在著差異,。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）,?？傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。
3．成纖維細(xì)胞的排除：
成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長,，致難以純化腫瘤細(xì)胞,。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長,。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵,。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表2－1）,。
表2－1 抑制成纖維細(xì)胞生長因素
方法 | 因素 | 組織細(xì)胞 |
選擇性附著 | 胰蛋白酶 | 胚胎小腸,、心肌,、表皮 |
注：上表結(jié)果為個別實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),，僅供參考
三,、成纖維細(xì)胞排除法
1．機(jī)械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成,，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）,。刮除程序?yàn)椋?/span>
（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位,；
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中,，肉眼或顯微鏡窺視下,，刮除無標(biāo)記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次,，洗除被刮掉的細(xì)胞,；
（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,，可重復(fù)刮除至*除掉為止
2．反復(fù)貼壁法：
根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn),，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,，使兩類細(xì)胞相互分離,，操作方法與傳代相同。
（1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后,，倒出舊培養(yǎng)液,，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次,，加入不含血清的培養(yǎng)液,，吹打制成細(xì)胞懸液；
（2）取編號為此A,、B,、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中,。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后,，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后,；向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),；
（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法,，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中,；再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。
當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后,，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞,，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞,。必要時可反復(fù)處理多次,，直至癌細(xì)胞純化為止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng),，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次,，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶,，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后,，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中,，離心去上清,，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng),；向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落,。經(jīng)過幾次反復(fù)處理,，可能把成纖維細(xì)胞除凈。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn),，通過消化進(jìn)行選擇,。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后,，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后,，更換新培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞,。如成纖維細(xì)胞未被除凈,，可再次重復(fù),。
5．其它方法：
有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液,，加入細(xì)胞懸液后,，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞,，在比重1.050～1.085層為上皮細(xì)胞,，再經(jīng)過分離進(jìn)行培養(yǎng)。近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長的方法,。
選用上述任何一種方法,，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn),，找出適合的條件,，才能獲得好的效果。
四,、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施
根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn),，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難,。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后,，常出現(xiàn)以下幾種情況：
*無細(xì)胞游出或移動；
有細(xì)胞移動和游出,，但無細(xì)胞增殖,，細(xì)胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；
有細(xì)胞增殖,，傳若干代后停止生長或衰退死亡,；
傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后,，才又呈旺盛生長狀態(tài),，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細(xì)胞系。
以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對體外生存條件有較高的要求,，并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長,，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法,，必須采用一些特殊的措施,。
1．適宜底物：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層,、飼細(xì)胞層等,。
2．生長因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物,，常用有胰島素,、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細(xì)胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量,，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后,，再從動物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率,。受體動物以裸鼠,。
3.動物體媒介培養(yǎng)方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污,，切成1～3毫米小塊,，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后,，直接刺入皮下，注入瘤塊,；
（2）飼養(yǎng)觀察,，待腫瘤生長達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織,；
（3）進(jìn)行體外培養(yǎng),。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代,。通過裸鼠媒介接種,，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功,。
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞*相同,，但成功率比正常細(xì)胞高。
五,、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測
一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后,，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定,，主要的目的在于求得證明：
所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞,，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性,。闡明一般生物學(xué)性狀,。測定項(xiàng)目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定,，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn),。
【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例,、染色質(zhì)和核仁大小,、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線,、細(xì)胞分裂指數(shù),、倍增時間、細(xì)胞周期時間,。
【細(xì)胞核型分析】檢測核型特點(diǎn),，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無,、帶型等,。
【凝集試驗(yàn)】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力,。
【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液,，觀察成瘤能力。
【其它】除上述項(xiàng)目外,，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記,、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等,。
在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測中,，主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng),、核型分析,、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項(xiàng)。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測,，這些項(xiàng)目將在本書第二篇中介紹,。
六、對腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評價
已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株,，無疑都是可用的實(shí)驗(yàn)對象,。近年我國已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應(yīng)用,。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗(yàn),，在使用這些細(xì)胞系時，應(yīng)持特別審慎態(tài)度,，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能,。*，長期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的,。另外也可能發(fā)生如基因突變,、基因易位或缺失等變化,。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例,，都已傳代少則幾十,，多則百代以上后，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系,。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時的性狀仍是一致的,。
已如前述，癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去,，凡已長期傳代的細(xì)胞系,，都已獲得不死性。當(dāng)前尚未*確證所有癌細(xì)胞都具有不死性,；因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時仍*相同（包括不死性）,。據(jù)上述對用癌細(xì)胞系所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論，避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論,，外推與體內(nèi)等同更是不妥的,。廣泛來說，應(yīng)用各種較長時間培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時,，都應(yīng)如此,。