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腫瘤細胞的培養(yǎng)
腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是多的,。另外腫瘤對人類是威脅大的疾病。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理,、抗癌藥檢測,、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用,。
一,、組織培養(yǎng)腫瘤細胞生物學特性
腫瘤細胞與體內正常細胞相比,，不論在體內或在體外，在形態(tài),、生長增值,、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞,，其差異較小,，但也并非*相同。培養(yǎng)中的腫瘤細胞具以下突出特點：
（－）形態(tài)和性狀
培養(yǎng)中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態(tài),，大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰,，核膜、核仁輪廓明顯,，核糖體顆粒豐富,。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則,，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關,。
（二）生長增殖
腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖,，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子,，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力,。正常細胞發(fā)生轉化后,，出現能在低血清培養(yǎng)基中生長的現象，已成為檢測細胞惡變的一個指標,。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉化后的單個細胞培養(yǎng)時,，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強,。另外癌細胞增殖數量增多擴展時,，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展,，形成堆積物,。
（三）永生性
永生性也稱不死性,。在體外培養(yǎng)中表現為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）,。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀,，體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在,。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此,？也尚難肯定,。從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的,，腫瘤細胞應易于培養(yǎng),。事實上,，多數腫瘤細胞初代培養(yǎng)時并不那么容易,。生長增殖并不旺盛,；經過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后,，便出現類似二倍體細胞培養(yǎng)中的停滯期,。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去,。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的,。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3,、Rat－1,、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀,，受不同基因調控,，但卻有相關性?？赡苡郎允羌毎麗鹤兊碾A段,。至少在體外是如此。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為,，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀,。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中,，并有穿透人工隔膜生長的能力,。
（五）異質性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性,、起源,、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織,；處于瘤體周邊區(qū)的細胞獲得血液供應多,，增殖旺盛，中心區(qū)有的細胞衰老退化,，有的處于周期阻滯狀態(tài),，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分,。腫瘤干細胞培養(yǎng)時易于生長增殖,；把干細胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細胞培養(yǎng)。
（六）細胞遺傳
大多數腫瘤細胞有遺傳學改變,，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等,。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成,，有干細胞系和數個亞系,，并不斷進行著適應性演變。
（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：
①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力,，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系,。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴,。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系,，可能影響癌細胞增殖生長的活性；
②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋,，達不到腫瘤生長的需求,，降低腫瘤細胞的生長增殖力；
③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的Life Span,，只有干細胞才有強的增殖生長能力,，但這些細胞數量很少；
④離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件,。
二,、培養(yǎng)方法
腫瘤細胞培養(yǎng)成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除,、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面,。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別,，初代培養(yǎng)應用組織塊和消化培養(yǎng)法均可,。
1．取材：
人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要,，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位,。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養(yǎng)材料,。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng),，可貯存于4℃中,，但不宜栽過24小時。
2．培養(yǎng)基：
腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格,，一般常用的 RPMIl640,、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng),。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低,，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長,。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應性較大,，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故,。但這并不說明腫瘤細胞*不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子,；腫瘤細胞與正常細胞之間,、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養(yǎng)中仍需要生長因子,。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）,。總之培養(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養(yǎng)更易成功,。
3．成纖維細胞的排除：
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長,，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快,，終能壓制腫瘤細胞的生長,。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）,。
表2－1 抑制成纖維細胞生長因素
方法 | 因素 | 組織細胞 |
選擇性附著 | 胰蛋白酶 | 胚胎小腸,、心肌、表皮 |
注：上表結果為個別實驗室經驗,，僅供參考
三,、成纖維細胞排除法
1．機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成,，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）,。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位,；
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液,，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下,，刮除無標記空間,；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞,；
（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),，如發(fā)現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至*除掉為止
2．反復貼壁法：
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點,，并結合使用不加血清的營養(yǎng)液,，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離,，操作方法與傳代相同,。
（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養(yǎng)液,，用胰酶消化后,，Hanks 沖洗2次,，加入不含血清的培養(yǎng)液,，吹打制成細胞懸液,；
（2）取編號為此A、B,、C三個培養(yǎng)瓶,；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后,，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后,；向A瓶中補充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),；
（3）培養(yǎng)B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法,，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中,；再向B瓶中補加*培養(yǎng)基。
當三個瓶內都含有培養(yǎng)液后,，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞,，B瓶兩類細胞相雜,，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次,，直至癌細胞純化為止,。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次,，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化,，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數細胞脫落下來后,，便立即停止消化,；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清,，吸入另瓶中,，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。用此法處理后,，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理,，可能把成纖維細胞除凈,。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點,，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,，當發(fā)現成纖維細胞被除掉后，即終止消化,；
（2）用Hanks洗滌處理一次后,，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng),，可獲純凈腫瘤細胞,。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復,。
5．其它方法：
有人發(fā)現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用,；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后,，在23℃中800g離心 10分種,。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞,，再經過分離進行培養(yǎng),。近也有人應用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法,，都需進行試驗,，取得必要經驗，找出適合的條件,，才能獲得好的效果,。
四、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施
根據人們的經驗,，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng),，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養(yǎng)后,，常出現以下幾種情況：
*無細胞游出或移動,；
有細胞移動和游出，但無細胞增殖,，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代,；
有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡,；
傳數代后細胞增殖緩慢,，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細胞系,。
以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求,，并需經過對新環(huán)境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果,，不能局限于一般培養(yǎng)法,，必須采用一些特殊的措施。
1．適宜底物：把經過純化的細胞接種在不同的底物上,，如鼠尾膠原底層,、飼細胞層等,。
2．生長因子：應用促細胞生長因子,，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物,，常用有胰島素,、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量,，可采用動物體轉嫁接種成瘤后,，再從動物體內取出進行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率,。受體動物以裸鼠,。
3.動物體媒介培養(yǎng)方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污,，切成1～3毫米小塊,，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后,，直接刺入皮下,，注入瘤塊；
（2）飼養(yǎng)觀察,，待腫瘤生長達較大體積后,，剝取出瘤組織；
（3）進行體外培養(yǎng),。
（4）為防止失敗,，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種,，有活力的腫瘤細胞數量增多,，細胞培養(yǎng)易于成功。
腫瘤細胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細胞*相同,，但成功率比正常細胞高,。
五、體外培養(yǎng)腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養(yǎng)的腫瘤細胞生長成形態(tài)上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系,，都需要做一系列的細胞生物學測定,，主要的目的在于求得證明：
所培養(yǎng)的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞,。均具有瘤種特異性,。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規(guī)定,，根據需要而定,，以下為常做的項目和要點。
【形態(tài)觀察】主要觀察細胞的一般形態(tài),，如大體形態(tài),、核漿比例、染色質和核仁大小,、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等,。
【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數,、倍增時間,、細胞周期時間。
【細胞核型分析】檢測核型特點,，染色體數量,、標記染色體的有無、帶型等,。
【凝集試驗】檢測凝集力,。
【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內（皮下）接種細胞懸液,，觀察成瘤能力,。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記,、組織化學成分分析,，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中,，主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤,、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析,、細胞骨架和電鏡觀察等幾項,。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書第二篇中介紹,。
六,、對腫瘤細胞系或細胞株的評價
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株,，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多,，并獲得越來越廣泛的應用,。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時,，應持特別審慎態(tài)度,，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。*,，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的,。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化,。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動,。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十,，多則百代以上后,，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的,。
已如前述，癌細胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去,，凡已長期傳代的細胞系,，都已獲得不死性。當前尚未*確證所有癌細胞都具有不死性,；因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍*相同（包括不死性）,。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論,，外推與體內等同更是不妥的,。廣泛來說，應用各種較長時間培養(yǎng)細胞做實驗時,，都應如此,。